Оценка активности репарации двухцепочечного разрыва ДНК с использованием высокопроизводительных и количественных репортерных анализов на основе люминесценции
14 июня 2024 г.
Мы представляем протоколы для оценки эффективности пути репарации двухцепочечного разрыва в клетках с использованием набора экстрахромосомных репортерных субстратов на основе люминесценции.
Компания Artios разрабатывает новые противораковые препараты, нацеленные на реакцию на повреждение ДНК. Чтобы сделать это возможным, мы разработали ряд новых анализов для измерения активности репарации клеточной ДНК. Эти анализы оказали значительное влияние на наши программы, что привело к тому, что клинические активы были протестированы на пациентах с высокими неудовлетворенными медицинскими потребностями.
Точное измерение целевой клеточной активности имеет важное значение для разработки новых таргетных методов лечения. Создание анализов на факторы репарации ДНК с необходимыми свойствами для стимулирования эффективной кампании по разработке лекарств было сложной задачей, будь то потребность в высокой пропускной способности, надежном соотношении сигнал/шум, быстром обороте и, в идеале, переносимости в различные биологические системы. Мы разработали набор надежных, количественных и титруемых репортерных анализов на основе люминесценции для измерения эффективности четырех основных путей восстановления двухцепочечных разрывов: гомологичной рекомбинации, негомологичного соединения концов, микрогомологически опосредованного соединения концов и одноцепочечного отжига.
Эти репортерные анализы подтверждены как считывающие репарацию, зависящую от пути, чувствительны к фармакологической модуляции и имеют быстрое время выполнения. Разработанные нами ремонтные подложки являются внехромосомными, поэтому их можно временно трансфицировать в интересующие модели и легко масштабировать в формат с высокой пропускной способностью. Мы считаем, что наши системы анализа играют важную роль в открытии лекарств для РДР, а также в углублении нашего понимания биологии РДР в более широком смысле.
В связи с этим мы надеемся, что эти методы помогут ускорить выявление и преследование новых мишеней для лекарств, что приведет к созданию лекарств для лечения таких заболеваний, как рак, где существует высокая неудовлетворенная медицинская потребность.
Обзор
В данной статье представлены протоколы оценки эффективности путей репарации двухцепочечных разрывов в клетках с использованием люминесцентных внехромосомных репортерных субстратов. Разработанные методы анализа имеют решающее значение для понимания ответа на повреждение ДНК и содействия поиску новых лекарственных препаратов в онкологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Ответ на повреждение ДНК
- Клеточные механизмы репарации
- Поиск новых онкологических препаратов
Теоретическая справка
- Двуцепочечные разрывы ДНК представляют собой критические повреждения, требующие эффективного восстановления.
- Понимание путей репарации необходимо для разработки методов таргетной терапии рака.
- Существующие методы анализа для измерения активности репарации ДНК имеют ограничения по пропускной способности и чувствительности.
- Новые методы анализа могут способствовать поиску лекарственных средств за счет точного измерения клеточной активности.
Цель исследования
- Разработать надежные методы анализа для измерения эффективности основных путей репарации двухцепочечных разрывов.
- Способствовать выявлению новых мишеней для лекарственных препаратов при лечении рака.
- Углубить понимание биологии ответа на повреждение ДНК.
Используемые методы
- Разработка люминесцентных репортерных анализов для четырех путей репарации.
- Транзиентная трансфекция экстрахромосомных субстратов в клеточные модели.
- Измерение люминесцентных сигналов для оценки эффективности репарации.
- Валидация анализов на предмет чувствительности к фармакологической модуляции.
Основные результаты
- Анализы продемонстрировали активность репарации, зависящую от конкретного пути.
- Количественные измерения показали чувствительность к модуляции препаратами.
- Было достигнуто сокращение времени получения результатов анализа.
- Данные анализы масштабируемы для высокопроизводительного скрининга.
Выводы
- Разработанные анализы являются ценными инструментами для поиска новых противоопухолевых препаратов.
- Они способствуют более глубокому пониманию механизмов репарации ДНК.
- Данные методы позволяют ускорить идентификацию новых терапевтических мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественные люминесцентные репортерные анализы репарации двухцепочечных разрывов ДНК позволяют проводить высокопроизводительное, путь-специфичное измерение активности клеточной репарации ДНК, что напрямую способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при поиске противоопухолевых препаратов. Эти анализы обеспечивают быстрые, воспроизводимые и масштабируемые результаты, необходимые для разработки средств терапии, воздействующих на ответ на повреждение ДНК (DDR). Их интеграция в процессы поиска лекарств повышает прогностическую достоверность и эффективность отбора активов, нацеленных на DDR.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую оценивать активность пути DDR для функциональной валидации мишеней.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем разграничения эффективности репарации, специфичной для конкретных путей.
- Способствует повышению прогностической уверенности в связывании с мишенью и биологической значимости.
- Ускоряет идентификацию и определение приоритетности новых мишеней для лекарственных препаратов, воздействующих на DDR.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели для надежной стандартизации анализа.
- Предлагает высокопроизводительные масштабируемые форматы, подходящие для скрининга соединений.
- Гарантирует воспроизводимость и возможность титрования в различных биологических системах.
- Позволяет достоверно оценивать фармакологическую модуляцию путей репарации ДНК.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет измерения восстановления специфических путей с биологией DDR, релевантной для заболевания.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации мишеней DDR.
- Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о развитии портфелей препаратов, нацеленных на DDR.
- Предоставляет механистическое понимание для разработки стратегий трансляционных биомаркеров.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данные анализы занимают определенное место в континууме открытий: от ранней валидации мишеней до идентификации ведущих соединений и доклинической оценки терапевтических средств, направленных на механизмы DDR.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей механизмов DDR.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа, воспроизводимость и количественные результаты для оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить высокочувствительные измерения люминесценции для сравнения активности репарации при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Позволяют сопоставлять эффективность клеточной репарации с моделями заболеваний, где это применимо.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает переносимую, масштабируемую платформу, адаптируемую к различным клеточным системам и программам поиска новых лекарственных средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней DDR.
- Операционная ценность: стандартизирует и ускоряет рабочие процессы анализа благодаря возможности высокопроизводительного масштабирования.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежных биологических показателей.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов, нацеленных на DDR.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области молекулярной биологии и разработки люминесцентных тестов.
- Необходим доступ к люминесцентным планшетным ридерам и стандартной инфраструктуре для культивирования клеток.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости анализа и сопоставимости данных.
- Метод адаптируем к различным клеточным моделям посредством транзиентной трансфекции внехромосомных субстратов.
- Результаты зависят от использования валидированных контролей для дифференциации специфической активности репарации путей.
