Быстрый магнитно-микрогранулированный метод для эффективной очистки нейтрофилов низкой плотности

Мы изучаем нейтрофилы низкой плотности в периферических мононуклеарных клетках крови, чтобы охарактеризовать их функции и определить роль в различных заболеваниях. Нейтрофилы низкой плотности редки в здоровой крови, но значительно увеличиваются при таких заболеваниях, как системная красная волчанка и рак. Для начала добавьте 10 единиц гепарина на миллилитр в качестве антикоагулянта в 15-миллилитровую коническую центрифугную трубку.

Затем добавьте два миллилитра 6%декстран T500 в PBS. Получить 10 миллилитров крови у здорового взрослого добровольца с помощью венипункции. В другой свежей 15-миллилитровой центрифугной трубке добавьте пять миллилитров среды градиента плотности.

Аккуратно выведите плазму пипеткой, не касаясь эритроцитов, и наложите её поверх среды, чтобы образовать две отдельные фазы. Центрифугуйте трубку при 516 г в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия. Для выделения PBMC нужно аспирировать и отбрасывать плазму выше зоны PBMC без нарушения клеток.

Соберите зону мононуклеарных клеток между плазмой и средой, минимизируя скопление среды. Добавьте 20 миллилитров PBS в трубку с PBMC, затем центрифугуйте при 400 г в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия. Аккуратно выпустите супернатант и соскребите трубку, чтобы отделить гранулу.

Добавьте 10 миллилитров холодного PBS для повторной суспензии клеток. Чтобы выделить нейтрофилы, соскреблите трубку, чтобы разделить клетки после пипетирования среды. Затем добавьте 10 миллилитров холодного PBS.

Теперь переместите клетки в свежую коническую центрифугную трубку объёмом 50 миллилитров и центрифуга. Аспирируйте супернатант и снова соскребите трубку. Теперь набейте в трубку 10 миллилитров холодного гипотонического раствора и аккуратно перемешайте.

Аккуратно перемешайте ровно одну минуту. Быстро добавьте 10 миллилитров холодного гипертонического раствора, чтобы сделать его изотоничным. Затем подсчитайте нейтрофилы с помощью камеры Нойбауэра и убедитесь, что чистота превышает 95%. Центрифугайте суспензию, чтобы получить клеточную гранулу.

Затем подвесьте гранулы в холодном PBS. Центрифугуйте периферические мононуклеарные клетки при 400 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. После удаления супернатанта снова суспензируйте клетки в 120 микролитрах холодного буфера.

Затем пипетка 35 микролитров магнитных микрошариков CD66b в суспензию клетки. Инкубировать смесь в темноте при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Теперь пипеткой прикрепите к трубке один миллилитр буфера для холодной мойки.

Центрифугуйте трубку при 400 г в течение трёх минут. Соскребли трубку, чтобы отделить клеточную гранулу после удаления супернатанта. И снова подвесить клетки в один миллилитр буфера для мытья.

Поставьте магнитный разделительный столб на магнит. Добавьте 0,5 миллилитра буфера для промывания в колонку, чтобы она полностью прошла. Перенесите один миллилитр подвешенных ячеек на колонку и дайте буферу пройти каплю за каплей.

После промывки переложите колонку в микроцентрифуговую трубку. Затем пипетить в колонку один миллилитр буфера для мойки. Теперь вставьте поршень сверху колонки.

Аккуратно приложите давление, чтобы элюировать клетки. Затем снимите поршень и поставьте колонку на новую микроцентрифугную трубку. Добавьте ещё миллилитр буфера для мойки в колонку.

Затем снова вставьте вантуз и аккуратно приложите давление, чтобы элюировать оставшиеся элементы. Центрифугуйте обе микроцентрифугные трубки при 800 г в течение трёх минут. Суспензируйте клеточные гранулы из обеих трубок в один миллилитр холодного PBS.

Держите подвеску ячейки на льду. Суспензировать очищенные клетки в буфере для маркировки, состоящий из сыворотки 1% плода крупного рогатого скота в PBS. Пересадите 250 микролитров подвески в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.

Добавьте соответствующие антитела к молекулам мембраны нейтрофилов в пробирку. Затем инкубировать клетки в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, защищённые от света. Теперь пипеткой один миллилитр PBS в трубку.

Прокрутите трубку в микроцентрифуге при 800 г в течение трёх минут. Аспирировать супернатант. Постучите по трубке, чтобы разбить гранулу.

И снова суспензировать клетки в 0,5 миллилитра 1% параформальдегида. Затем держать клетки при температуре четырёх градусов Цельсия, защищённые от света до анализа с помощью потоковой цитометрии. Анализируйте образцы с помощью потоковой цитометрии, фиксируя 10 000 событий на образец.

Нейтрофилы низкой плотности у здоровых людей составляли примерно 5% периферических мононуклеарных клеток крови, тогда как описанный протокол магнитной изоляции дал нейтрофилы низкой плотности с результатом около 98% восстановления. Нейтрофилы экспрессируют мембранные маркеры CD10, CD11b, CD15, CD62L и CD66b. Магнитно очищенные низкоплотные нейтрофилы экспрессировали те же мембранные маркеры, что и нейтрофилы.

Очищенные нейтрофилы низкой плотности имели многолобулированное ядро и по размеру были схожи с нейтрофилы. И нейтрофилы, и нейтрофилы низкой плотности генерировали реактивные кислородные формы в ответ на стимуляцию ПМА, при этом нейтрофилы низкой плотности производили более высокие уровни, чем нейтрофилы. Нейтрофилы низкой плотности выделяли нейтрофильные внеклеточные ловушки в ответ на стимуляцию ПМА, что подтверждается колокализацией ДНК с помощью эластазы и цитруллина.

Как очищенные нейтрофилы, так и нейтрофилы низкой плотности выделяли НЭТ с похожей кинетикой и количеством после обработки ПМА. Наш протокол обеспечивает быстрый и воспроизводимый способ получения высокочистых и функциональных нейтрофилов низкой плотности. Мы рассматриваем отсутствие стандартизированного, эффективного по времени протокола для выделения нейтрофилов низкой плотности из человеческой крови.

Этот протокол не требует специального обучения по сложным приборам, а также более экономичный и быстрый, чем FACS.