Репрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из образцов замороженных образцов шерсти Buffy

Цель этого протокола — перепрограммировать замороженные человеческие шерсти (PBMC) на индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Этот протокол уникально очищает шерсть баффи после размораивания и выявляет морфологию соматической клетки, свидетельствующую об успешном перепрограммировании. Для начала достаньте замороженное пальто баффи, полученное из человеческой крови, и положите его на лёд.

Аккуратно помешайте образец в водяной ванне при температуре 37 градусов Цельсия и уберите флакон, когда останется лишь небольшой ледяной кристалл. Аккуратно переместите содержимое флакона по капле в коническую трубку с 12 миллилитрами DPBS. Прополосните флакон одним миллилитром DPBS и добавьте промывку в коническую трубку с извлечёнными клетками.

Центрифугуйте образец с помощью вращающегося ротора при 200 г при комнатной температуре в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в четырёх миллилитрах DPBS с содержанием 1% FBS. Далее аккуратно нанесите смесь Buffy слоя поверх трёх миллилитров раствора градиента плотности, избегая смешивания на границе.

Центрифуга с помощью вращающегося ротора при 800 г в течение 20 минут при комнатной температуре с выключенным тормозом. С помощью пипетки удаляют и сбрасывают верхний слой плазмы, не нарушая границу между плазмой и градиентом. Затем удалять периферическую мононуклеарную клеток, или слой PBMC, на границе и переносить его в чистую трубку объемом 15 миллилитров.

Помойте PBMC, добавив три миллилитра расширяющей среды и центрифугая при 200 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и восстановите гранулу в двух миллилитрах среды расширения, содержащей цитокины, такие как SCF, IL-3, EPO и IGF-1. Закройте ячейки в одну яме из 12-лунной пластины.

Культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа и 20% кислорода в течение 10–14 дней. Заменяйте половину среды через день, пока не появится плотная популяция ярких, круглых эритропластов, что указывает на готовность клеток к трансдукции. Через три дня после передачи вируса Сэндай, несущего факторы Яманака, поместите клетки на эмбриональные фибробласты мышей с температурой по два миллилитра на колодцу.

Инкубировать культуры около семи дней, кормя новые колонии hESC средой через день. Поместите пластину, содержащую трансдуцированные клетки и появляющиеся колонии, под расщепляющим микроскопом. Используйте микроскоп, чтобы найти одну колонию, чтобы поднять крышку пластины и открыть колодец.

Асептически откройте шприц и обнажите иглу. Под контролем микроскопа используйте кончик иглы, чтобы отделить колонию от окружающих питательных клеток, обводя контуры колонии. Используйте кончик иглы, чтобы разрезать колонию на несколько одинаковых кусочков.

Если кусочки не отсоединились, используйте бок иглы, чтобы зачерпнуть или соскребать их с тарелки, пока они не начнут плавать. Теперь, используя пипетку P200, найдите выбранную колонию под микроскопом, аспирируете плавающую колонию пипеткой и перенесите её в яме подготовленной пластины на 24 лунки. Убедитесь, что вся колония будет перенесена без сбора других колоний или питательных клеток.

Поставьте пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа и 20% кислорода, пока не будет достигнуто желаемого соединения. Определите колонии, которые крупные, круглые и имеют светящиеся края как готовые к расщеплению. Аспирируйте среду из колодца и промывайте образец один миллилитр DPBS.

Затем удалите DPBS и добавьте 500 микролитров буфера диссоциации 0,5 миллимолярного ЭДТА. Инкубировать образец при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение двух минут, пока колонии не расслабятся и клетки не округлятся. Далее вынимите пластину из инкубатора и аспирируйте буфер диссоциации ЭДТА.

С помощью пипетки P1000 собирайте клетки с помощью одного миллилитра человеческой плюрипотентной стволовой среды, аккуратно пипетируя вверх и вниз, пока колонии не будут отделены и слегка раздроблены. Перенесите один миллилитр среды и клетки в новую пластину с шестью лунками, содержащую один миллилитр свежей человеческой плюрипотентной стволовой клеточной среды. Поместите клетки в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа и 20% кислорода.

Ежедневно кормите индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, пока колодец не соединится и не будет готов к расщеплению. Тем временем обложите чашу диаметром 10 сантиметров раствором витронектина 7 миллилитрами 5 микрограмм на миллилитр, приготовленным в DPBS, и инкубируете при комнатной температуре в течение одного часа. Для дальнейшего расщепления добавьте 7–10 миллилитров человеческой плюрипотентной стволовой клеток в 10-сантиметровую чашу и перенесите клетки из шести-колодной пластины в чашу в соотношении 1:1 и инкубировать, как показано ранее.

Убедитесь, что клетки в 10-сантиметровой антенне слились, прежде чем снова разделить клетки. Корректируйте коэффициент разделения в зависимости от морфологии и плотности клеток, обычно используя соотношение 1:10, и отмечайте номер пассажа в каждом отрывке. Наконец, охарактеризовать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путём подтверждения экспрессии маркера ствола NANOG с помощью иммунофлуоресценции.

Дифференцировать клетки на линии эктодермы, мезодермы и энтодермы с использованием определённых условий культуры. Оценить потенциал дифференцировки с помощью окрашивания PAX6, брахюрия и SOX17, а также потери экспрессии NANOG. В конце расширения PBMC дифференцировались в эритропласты, представляющие собой яркие, круглые клетки большого и малого размера.

В то время как культуры без этих клеток или выглядящие мёртвыми вряд ли могли успешно перепрограммироваться. Успешная трансдукция и перепрограммирование были отмечены появлением индуцированных плюрипотентных колоний стволовых клеток на облучённых питательных клетках, которые затем развили типичную морфологию стволовых клеток. В то время как клетки, не принявшие морфологию, похожую на стволовые клетки, не были успешно перепрограммированы.

Успешно перепрограммированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки имели плотные круглые колонии с гладкими, яркими краями. Подклоны с менее идеальной морфологией, такие как спонтанная дифференцировка или плотные центры, очищались путём корректировки условий расщепления. Некоторые собранные колонии не смогли успешно расшириться.

Помимо морфологии, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки проявили ствол, что подтверждается экспрессией маркера ствола NANOG. Перепрограммированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки продемонстрировали потенциал дифференцировки в эктодерму, мезодерму и энтодерму. Этот протокол предоставляет подробные контрольные точки для отслеживания и прогнозирования успеха перепрограммирования.

Для дополнительного подтверждения пригодности линии iPSC необходимо провести кариотипирование, генотипирование и регулярное тестирование микоплазмы. Этот протокол позволяет перепрограммировать существующие популяции пациентов с биобанкинговыми пальто-баффи, расширяя возможности технологии iPSC.