Анализ Вестернблот

Иммуноблоттинг, который часто называют вестерн-блоттингом, используется для идентификации в образце белка специфических антигенов, распознаваемых поликлональными или моноклональными антителами. Эта процедура обычно следует за одномерным или двумерным электрофорезом в геле и включает перенос разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны. Далее следует инкубация этих мембран с первичными и вторичными антителами, которые прямо или косвенно конъюгированы с ферментами, и визуализация белковых антигенов на мембранах с помощью реакций с цветными или флуоресцентными субстратами.

В данном видео мы представляем пошаговую демонстрацию процедуры иммуноблоттинга. Здравствуйте, я Шон Галлахер из UVPI, сотрудничаю с протеомным центром здесь, в Высшем институте Кей (KE Graduate Institute). Сегодня я продемонстрирую вам анализ методом иммуноблоттинга.

Этот процесс включает в себя ряд этапов, в том числе разделение белков, их перенос (блоттинг) на мембраны, иммунозондирование и визуализацию с использованием хромогенных и хемолюминесцентных субстратов. Итак, приступим. Перед началом процедуры иммуноблоттинга образцы белков должны быть разделены методом электрофореза с использованием малых или стандартных одномерных или двумерных гелей.

Подготовьте антигенные образцы и внесите их в лунки геля, включив в одну или несколько лунок предварительно окрашенный или биотинилированный белок, а также стандарты молекулярной массы. Эти белковые маркеры перенесутся на мембрану и позволят удобно определить ориентацию мембраны и размеры белков после иммуноокрашивания. После завершения электрофореза можно приступать к сборке иммуноблоттинга.

Для сборки иммуноблота сначала разберите «сэндвич» из гелей и удалите концентрирующий гель. Выдержите гель в течение 30 минут при комнатной температуре в буфере для переноса; эта процедура необходима для предотвращения изменения размера геля во время переноса. Начните сборку «сэндвича» для переноса в кювете, достаточно большой, чтобы в нее поместилась пластиковая кассета для переноса, предварительно наполнив ее буфером для переноса так, чтобы кассета была полностью погружена. Теперь поместите подушечку Scotch-Brite или губку в нижнюю часть пластиковой кассеты для переноса.

Затем возьмите лист фильтровальной бумаги, вырезанный по размеру геля. Предварительно смочите его буфером для переноса и поместите поверх губки Scotch-Brite. По истечении 30 минут эквилибрации геля положите гель на фильтровальную бумагу.

Удалите все пузырьки воздуха между гелем и фильтровальной бумагой, осторожно прокатывая по поверхности геля пробирку или стеклянную палочку. Также можно использовать ролик BioRad, входящий в комплект BioRad. Помните о необходимости использовать перчатки при работе с фильтровальной бумагой, гелями и мембранами.

Жир с ваших рук может помешать переносу. Далее подготовьте мембрану для переноса. Вырежьте мембрану так, чтобы она была того же размера, что и гель, с припуском в один-два миллиметра по каждому краю.

Затем медленно поместите мембрану в дистиллированную воду одним краем под углом 45 градусов; вода будет подниматься по мембране, со временем смачивая всю ее поверхность. Если погружать мембрану в воду слишком быстро, внутри могут образоваться пузырьки воздуха, которые проявятся в виде белых пятен. Белок не перенесется на такие участки.

После полного смачивания мембраны выдерживайте ее в течение 10–15 минут в буфере для переноса. Эта процедура смачивания подходит для нитроцеллюлозных и нейлоновых мембран. Только мембраны из ПВДФ гидрофобны и не будут смачиваться при простом помещении в дистиллированную воду или буфер для переноса.

Мембраны из ПВДФ необходимо сначала погрузить в 100% метанол на одну-две секунды, затем выдержать в течение 10–15 минут в буфере для переноса. Не допускайте высыхания мембраны на любом из этапов.

Затем снова увлажните мембрану метанолом, а после — буфером для переноса. Когда мембрана будет готова, поместите предварительно увлажненную мембрану непосредственно на верхнюю сторону геля. Не забудьте удалить все пузырьки воздуха между гелем и мембраной, осторожно прокатив стеклянную палочку от пробирки или ролик BioRad по поверхности мембраны.

Затем смочите еще один кусочек фильтровальной бумаги Whatman толщиной 3 мм. Поместите его поверх мембраны и снова удалите все пузырьки воздуха. После этого положите сверху на фильтровальную бумагу еще одну губку или абразивную салфетку Scotch-Brite.

Завершите сборку «сэндвича» для иммуноблоттинга, зафиксировав верхнюю часть кассеты для переноса. Теперь, когда «сэндвич» для иммуноблоттинга собран, можно приступить к переносу белков из геля на мембрану. Для начала процедуры переноса наполните камеру для электроблоттинга буфером для переноса и поместите кассету с собранным «сэндвичем» в аппарат для электроблоттинга.

Важно собрать «сэндвич» таким образом, чтобы мембрана была обращена к аноду или положительно заряженной стороне камеры. Подключите провода блока питания к соответствующим анодной и катодной сторонам установки для электроблоттинга. Данная модель блоттера оснащена охлаждающим ледяным блоком.

Теперь проведите электрофоретический перенос белков с геля на мембрану в течение 30–60 минут при 50 В с охлаждением или в течение ночи при 14 В в холодильной комнате. По завершении переноса выключите источник питания и разберите установку. Затем извлеките мембрану из аппарата для блоттинга и отметьте её ориентацию, отрезав уголок.

На данном этапе мембраны можно высушить и хранить в плотно закрывающемся пластиковом пакете при температуре 4 °C в течение одного года. Перед дальнейшей обработкой высушенные мембраны из PVDF необходимо поместить в небольшое количество 100% метанола для увлажнения, а затем в дистиллированную воду для удаления метанола.

После того как ориентация будет отмечена, окрасьте гель, чтобы проверить эффективность переноса. Для визуализации перенесенных белков можно использовать либо обратимое окрашивание мембраны красителем cipro ruby, либо необратимое окрашивание чернилами kamasi blue India ink, нафтоловым синим или коллоидным золотом. Эти процедуры необратимого окрашивания несовместимы с нейлоновыми мембранами.

После переноса белков на мембрану переходите к иммунозондированию и визуальному обнаружению белков. На этом этапе иммобилизованные на мембране белки обрабатывают специфическими антителами для идентификации и количественного определения присутствующих антигенов. Для начала поместите мембрану в пластиковый инкубационный лоток с 20 milliliters блокирующего буфера.

Некоторые используют пакеты, но чаще применяют кюветы, так как они особенно удобны при обработке большого количества полосок в различных растворах первичных антител. Затем инкубируйте запечатанную мембрану от 30 до 60 минут при комнатной температуре с перемешиванием на орбитальном шейкере или качалке. Пока мембрана инкубируется, разведите первичные антитела и блокирующий буфер.

Разведение определяется эмпирически, но обычно составляет от 1:100 до 1:1000. Для поликлональных антител используют разведения от 1:10 до 1:100 для супернатантов гибридом, и более 1:1000 для жидкостей мышиного происхождения, содержащих моноклональные антитела. По завершении инкубации слейте блокирующий буфер.

Замените буфер разведенными первичными антителами и снова инкубируйте в течение 30–60 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Затем четырежды промойте мембрану, встряхивая ее с 100 миллилитрами TTBS для фильтров из нитроцеллюлозы или PVDF или TBS для нейлоновых фильтров.

Каждую стадию промывки мембраны следует проводить в течение 10–15 минут; вторичные антитела разводят в блокирующем буфере. Примерами вторичных антител являются конъюгаты с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой, анти-IG конъюгаты, а также коммерчески доступные конъюгаты с ферментами. Перед использованием вторичные антитела обычно разводят в соотношении от 1:200 до 1:25 000.

После завершения этапов промывки и удаления промывочных материалов добавьте разведенный конъюгат анти-IG с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой и инкубируйте от 30 до 60 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Через 30–60 минут извлеките мембрану из контейнера и промойте ее четыре раза, по 10–15 минут каждый раз, в TTBS, как описано ранее.

После завершения промывок можно переходить к этапу визуализации. Однако сначала мы продемонстрируем альтернативную процедуру иммунозондирования. Эта альтернативная процедура основана на использовании набора Vector Stain ABC от Vector Labs.

В данной методике используется авидин-биотиновый комплекс для прикрепления пероксидазы хрена (HRP) или щелочной фосфатазы (AP) к биотинилированным вторичным антителам. Сегодня мы продемонстрируем работу с набором HRP. TTBS хорошо подходит в качестве блокирующего буфера для авидин-биотиновых систем.

Однако для нейлоновых фильтров рекомендуется использовать реагенты для связывания белков, поскольку обезжиренное сухое молоко содержит остаточный биотин, который будет мешать проведению иммуноанализа. Его следует использовать только на этапе блокировки: начните с уравновешивания мембраны в блокирующем буфере в открытом лотке при постоянном перемешивании с помощью орбитального шейкера или качающейся платформы. Инкубируйте мембрану от 30 до 60 минут при комнатной температуре во время процесса уравновешивания.

Приготовьте раствор первичных антител. Используйте TTBS для мембран из нитроцеллюлозы или PVDF при использовании высокочувствительных систем Aden. Biotin.

Разведение сыворотки, содержащей первичные антитела, обычно варьирует от 1:1000 до 1:100 000. Использование хемилюминесцентного метода требует более высоких разведений. В нашем случае демонстрируется хромогенный метод.

Мы используем первичные антитела в разведении 1:5 000. По завершении уравновешивания удалите блокирующий буфер. Затем добавьте достаточное количество раствора первичных антител, чтобы полностью покрыть мембрану.

Инкубируйте мембрану в течение 30 минут при комнатной температуре при осторожном раскачивании. Промойте мембрану трижды в TTBS для нитроцеллюлозы с интервалами в пять минут. Во время этапа промывки приготовьте раствор биотинилированных вторичных антител, разбавив одну каплю биотинилированных антител в 10 миллилитрах TTBS. По завершении этапов промывки добавьте раствор вторичных антител.

Инкубируйте мембрану в течение 30 минут при комнатной температуре с медленным покачиванием, пока мембрана инкубируется со вторичными антителами. Для этого подготовьте Avadon biotin HRPO. Смешайте две капли реагента Vti stain A и две капли реагента B в 10 миллилитрах.

Раствор TTBS для нитроцеллюлозы. После завершения инкубации со вторичными антителами выдержать в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть мембрану трижды в течение 15 минут раствором TTBS или TBS.

Затем нанесите на мембрану раствор фермента авидина с биотином и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре при медленном перемешивании. После этого промойте мембрану трижды с интервалом в 10 минут раствором TTBS. Теперь, когда процедура иммунозондирования завершена, белки, связанные с мембраной, готовы к визуализации с помощью хромогенных субстратов.

Для этого заключительного этапа визуализации в процедурах иммунодетекции на основе пероксидазы хрена обычно используются субстраты CN dab/ICL 2 и TMB. Если последняя промывка мембраны в ходе процедуры иммунозондирования проводилась в TTBS, то промойте мембрану в 50 мл TBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем поместите мембрану в раствор для хромогенной визуализации.

Полосы белков должны появиться через 10–30 минут. После 30-минутной инкубации удалите смесь для реакции с субстратом и остановите реакцию, добавив дистиллированную воду. Иммуноблоттинг представляет собой многоэтапную процедуру, используемую в тысячах лабораторий для обнаружения специфических белков после одномерного или двухмерного электрофореза.

Я только что продемонстрировал вам, как проводить иммуноанализ крови. На этом всё. Желаю удачи в ваших экспериментах и спасибо за просмотр.