Мультиплексированный Флуорометрический Методология тестирования иммунологического анализа и устранение неисправностей

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении антител к посторонним инфекционным агентам у лабораторных животных. Это достигается путем инкубации исследуемой сыворотки с микросферами, покрытыми антигеном. Затем сыворотка инкубируется с биотинилированным видоспецифическим антииммуноглобулином, который выявляет любые иммунные комплексы антиген-антитело.

Затем добавляется раствор FICO eryn Fluor force, меченный стрептавидином, для обнаружения любых biotinylated immunoglobulin. Полученные результаты показывают положительный или отрицательный статус антител к распространенным агентам у лабораторных грызунов на основе мультиплексной флуоресценции, суммарного балла иммуноанализа и значений флуоресценции образцов. Основным преимуществом использования данного метода по сравнению с существующими методами, такими как ELISA, является то, что MFIA представляет собой мультиплексный анализ. Это позволяет исследователю проводить до ста различных анализов в рамках одного теста.

Данный метод позволяет сократить объем используемых образцов сыворотки и количество одноразовых расходных материалов по сравнению с существующими методами, одновременно увеличивая объем информации, получаемой в ходе одного анализа. Идея применения данного метода возникла у нас при тестировании большого количества образцов сыворотки на наличие нескольких агентов, когда возникла необходимость сократить трудозатраты и время проведения исследований. Процедуру продемонстрирует Донна Коэн, старший технолог нашей лаборатории. Для начала подготовьте два буферных раствора, необходимых для проведения мультиплексного флуоресцентного иммуноанализа (MFIA).

Первым является первичный разбавитель, который можно приобрести у компании Charles River; он содержит запатентованные блокирующие агенты для снижения неспецифических взаимодействий в буфере для промывки при анализе. Приготовьте раствор PBS с 1% BSA pH 7.4 для удаления твердых частиц. Профильтруйте буфер через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0.2 мкм в стерильные промаркированные контейнеры, используя буфер для промывки при анализе.

Подготовьте двухкратные концентрации биотинилированных антител к соответствующим видам, IgG или BAG, а также стрептавидина и фикоэритрина или SPE, которые будут использоваться для маркировки комплексов антиген-антитело, образовавшихся на этапе инкубации с тестовой сывороткой. Подготовьте следующие материалы и расходные материалы: многоканальные и одноканальные микропипетки с соответствующими наконечниками, а также 96-луночные микротитрационные планшеты с низкой сорбцией белков для разведения белков. После сбора образцов крови и выделения сыворотки кратковременно перемешайте сыворотку на вортексе перед разведением образцов в первичном разбавителе в 96-луночном микротитрационном планшете. Для обеспечения правильного и равномерного опорожнения лунок предварительно увлажните каждую лунку 96-луночного тестового планшета промывочным буфером для анализа; медленно аспирируйте раствор на протяжении всего анализа.

Аспирация должна занимать от пяти до 10 секунд, чтобы предотвратить агрегацию микросфер и их уплотнение в фильтрующей мембране, так как оба этих фактора могут увеличить время считывания в конце анализа. Убедитесь, что слив жидкости прекратился, промакнув нижнюю сторону тест-планшета бумажными полотенцами. Важно промакивать тест-планшет после каждого этапа промывки, чтобы предотвратить вытягивание жидкости из лунок во время инкубации.

Для подготовки бусин начните с перемешивания исходной суспензии конъюгированных бусин на вортексе. Затем подвергните их кратковременной ультразвуковой обработке в ультразвуковой бане. Крайне важно правильно ресуспендировать бусины, чтобы предотвратить образование агрегатов, которые могут привести к увеличению времени считывания.

Затем перенесите стоковую суспензию (20x) в двухкратный (2x) рабочий раствор микросфер в первичном разбавителе. После этого внесите по 50 µL двухкратной (2x) суспензии микросфер в каждую лунку предварительно увлажненного планшета для анализа. С помощью пипетки внесите по 50 µL каждой двухкратной (2x) тестовой и контрольной сыворотки в лунки планшета согласно заранее определенной схеме расположения образцов.

Плотно закройте планшет крышкой. Накройте его алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение 60 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре, чтобы избежать испарения растворов, которое может привести к неудаче анализа. На всех этапах инкубации держите планшет закрытым с помощью крышки.

Кроме того, скорость встряхивания должна составлять от 400 до 700 RPM, чтобы бусины оставались во взвешенном состоянии, обеспечивая доступ антител сыворотки ко всем поверхностям конъюгированных антигенов. После промывки планшета в ходе последовательных инкубаций бусин с BAG и SPE повторно промойте образцы. Затем ресуспендируйте бусины, добавив 125 microliters промывочного буфера для анализа, и встряхивайте в течение двух минут перед считыванием планшета.

Поместите планшет в анализатор в течение 10 минут после ресуспендирования частиц; частицы поочередно проходят через детектор, где они подвергаются воздействию двух лазеров. Один лазер возбуждает внутренние красители, которые определяют цветовой набор частиц, а другой — репортерный краситель FICO erything. Интенсивность флуоресценции FICO erything для заданного количества частиц регистрируется как FM FI; считывайте первую лунку, чтобы убедиться, что выбранная панель частиц соответствует профилю частиц в тестовых лунках.

Если на дисплее протокола видны гранулы, выходящие за пределы специально отведенной для них области, значит, был выбран неправильный профиль. Правильно ресуспендированные гранулы заполнят указанные области в соответствии с показаниями программного обеспечения ридера. Если гранулы агрегированы, они будут заполнять свои области медленно.

Вы можете извлечь планшет с образцами из ридера и вручную ресуспендировать содержимое лунок для разделения микросфер. Извлеките планшет из ридера и с помощью многоканального дозатора перемешайте содержимое каждой лунки три-четыре раза. Затем верните планшет в ридер и продолжите анализ результатов.

Сообщайте об ошибках, таких как недостаточное количество микросфер или снижение показателей IgG anti IgG микросфер, и повторите анализ для этих образцов. После экспорта данных в Excel и расчета чистого MFI определите, не вышел ли за пределы допустимых значений какой-либо из контролей анализа, за исключением иммунной сыворотки высокого диапазона. Любые неудачные контрольные показатели считаются неприемлемыми, и анализ должен быть повторен.

В данной таблице представлены данные для исследуемой сыворотки и контролей анализа с типичного планшета. Все контроли IgG прошли проверку. Результаты анализа для данного планшета указывают на то, что многочисленные образцы с тканевой реактивностью и контроли IgG не прошли проверку, что отмечено оранжевым цветом лунок.

A1C1 и F1 указывают на реактивную неудачу ткани TC, где показатель TC указан в скобках; Wells B1 и E1 иллюстрируют два типа неудач внутреннего контроля IgG: недостаточное количество тестовых антител или тестовых реагентов, BAG или SPE соответственно. Результаты тестовой планшетки интерпретируются только в том случае, если контроль пригодности системы и контроль сыворотки соответствуют приведенным здесь критериям приемлемости. Микросферы, покрытые видоспецифичными иммуноглобулинами к тестовой сыворотке, могут показывать неудовлетворительные результаты из-за добавления недостаточного количества образца, слишком высокого разведения образца, использования неправильного вида или тестирования сыворотки иммунодефицитного организма.

Если результаты контрольного анализа проб удовлетворительны, индивидуальные показатели анализа классифицируются следующим образом. После выполнения этой процедуры следует использовать дополнительные методы, такие как ELISA, IFA и/или вестерн-блоттинг, для подтверждения первоначальных неожиданных или положительных результатов. Крайне важно проверить эти данные перед принятием любых решений по управлению поголовьем животных.

Это можно осуществить, используя различные методики для одного и того же образца или дополнительных образцов из той же колонии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить мультиплексный флуоресцентный иммуноанализ и интерпретировать результаты, полученные в вашем учреждении. Это позволит вам сократить трудозатраты, получая при этом больше информации из каждой лунки с исследуемым образцом.