Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

Здравствуйте, я Коди Лок из лаборатории Колдуэлла факультета биологических наук Университета Алабамы. Я Кайл Ли, и я покажу вам, как подготовить червей для анализов с воздействием outta carb и PTZ. Я Бернард Ту, и я продемонстрирую вам, как проводить анализы out carb.

Меня зовут Кейлин Берри, я отвечаю за видеоролики по *C. elegans*. В данной презентации я выступлю в роли диктора и продемонстрирую метод анализа воздействия ПТЗ. Сегодня мы с коллегами покажем, как с помощью серии репрезентативных мутантных штаммов характеризовать мутантов синаптической передачи с использованием модели эпилепсии на *C. elegans* после воздействия ПТЗ и альдекарба.

Итак, приступим. Кайл Ли начнет сегодняшний показ, продемонстрировав подготовку к анализам ALD carb в первый день процедуры. Убедитесь, что к анализам ALD carb на второй день будет доступно не менее 30 червей стадии молодых взрослых особей каждого генотипа и каждой повторности.

Рекомендуется отобрать 50 или более червей L4 на свежие чашки NGM без фунгицидов с посевом e coli OP 50 в качестве источника пищи. Культивируйте червей от 12 до 24 часов при постоянной пермиссивной температуре. Оптимальным диапазоном является от 20 °C до 22 °C, хотя температура 25 °C также допустима.

На второй день приготовьте 100 мМ стоковый раствор Al Decarb и 70% раствор этанола, затем нанесите соответствующее количество Al Decarb на чашки с NGM. Мы постоянно используем 0,5 мМ Al Decarb, нанося 37,5 µL 100 мМ Al Decarb на чашки Петри диаметром 60 мм без вентиляционных отверстий, содержащие 7,5 мл NGM. Дайте чашкам с Al Decarb высохнуть примерно 30–60 минут при комнатной температуре.

После высыхания чашек приоткрывать крышки не требуется. Нанесите одинаковые объемы e coli в центр каждой чашки с альдегидным карбонилом и подсушите еще в течение 30–60 минут. При комнатной температуре мы обычно добавляем 25 µL e coli OP 50.

Такой объем OP 50 позволяет создать пищевой газон достаточного размера, чтобы черви оставались в небольшой области в центре чашки, не переполняя ее. После высыхания пищевого газона приступайте к анализу содержания альбукарба. В связи с субъективным характером анализа альбукарба настоятельно рекомендуется проводить эксперименты слепым методом.

Для этого коллега основного экспериментатора перемаркирует исходные чашки с червями, предназначенными для анализа, или же коллега может перенести червей с исходных чашек на чашки с цифералдекарбом непосредственно перед запуском таймера. Теперь, когда чашки подготовлены, ABO переходит к анализу; для начала анализа подсчитывают количество парализованных червей.

Существует два основных подхода к определению паралича, вызванного острым декарбоксилированием. Первый подход определяет паралич по прекращению глоточного пампинга. В данной видеозаметке видна темная структура, расположенная в просвете глотки червя в правой части экрана.

Эта структура называется гриндером и ритмично сокращается посредством холинергического механизма. Передвижение червя на данном видео значительно замедлено из-за воздействия Al Decarb. Тем не менее, гриндер глотки этого червя все еще отчетливо движется.

Следовательно, данный червь не считается парализованным на основании прекращения перекачки. В этом видео должно быть видно, что глоточная мельница, расположенная в правой части экрана, не сокращается, что соответствует рабочему определению паралича, вызванного al Decarb. Данный червь должен быть отмечен как парализованный.

Однако, подобно червю из предыдущего видео, этот червь совершает легкие боковые поисковые движения. Несмотря на нарушение локомоции, вызванное Al Decarb, такие движения помешали бы экспериментатору счесть этого червя парализованным согласно второму подходу к определению паралича, индуцированного Al Decarb: полной неподвижности тела и отсутствию реакции на прикосновение. Второй подход к определению паралича, индуцированного Al Decarb, заключается в последовательном стимулировании каждого червя платиновой проволокой и проверке наличия ответа.

Если движения тела не обнаруживаются невооруженным глазом, рекомендуемым подходом является стимуляция червей путем двух прикосновений в области головы и двух в области хвоста каждые 30 минут в течение трех часов. Как видно на данном видео, тело червя не совершает явных движений. Тем не менее, поскольку данный червь реагирует на стимуляцию отчетливым движением хвоста, мы не считаем его парализованным.

Согласно второму определению, наблюдается паралич, вызванный декарбоксилированием. Как и червь в предыдущем видео, этот червь не проявляет явных движений тела, поэтому требуется проведение пробы на раздражение. Однако, в отличие от червя из предыдущего видео, данный червь не демонстрирует четкой реакции на раздражение.

Таким образом, этот червь считается парализованным согласно второму определению паралича, индуцированного Al Decarb. Хотя разница между состоянием паралича и отсутствием паралича при воздействии Al Decarb может быть незначительной, экспериментаторы должны иметь возможность выявлять существенные изменения синаптической передачи, просто наблюдая за большим количеством репрезентативных червей, подвергнутых воздействию Al Decarb сразу после переноса на чашки с Al Decarb. Черви дикого типа остаются подвижными.

В этом видео представлены те же черви дикого типа, что и в предыдущем ролике, спустя один час воздействия Al Decarb. Обратите внимание, что скорость движения червей в некоторой степени снизилась, однако они все еще отчетливо двигаются.

В отличие от червей дикого типа, мутанты tomasin one в данном видео либо полностью обездвижены, либо почти не двигаются после одного часа воздействия. Этот результат согласуется с тем, что у мутантов tomasin one наблюдается избыточная секреция ацетилхолина из-за неспособности осуществлять отрицательную регуляцию высвобождения нейромедиатора в нервно-мышечных соединениях; избыток ацетилхолина в синаптических щелях нервно-мышечных соединений в сочетании с ингибированием деградации ацетилхолина под действием Bial Decarb делает мутантов tomasin one гиперчувствительными. Хотя здесь это не показано, предполагается, что аналогичные результаты возникают при анализах с использованием alde carb у аллелей с потерей функции on 43, который кодирует ортолог C. elegance кальций-кальмодулин-зависимой протеинкиназы 2. В данном видео показаны мутанты on 25, у которых наблюдается дефицит тормозной ГАМК-ергической передачи.

После одного часа воздействия al Decarb, подобно мутантам tomasin one и M 43, данные мутанты демонстрируют значительные нарушения локомоторной функции, вызванные al Decarb, и, по всей видимости, подвержены более сильному воздействию, чем черви дикого типа при экспозиции с al Decarb в течение того же периода времени. Этот результат согласуется с тем, что у мутантов M 25 происходит гиперстимуляция мышц body wall вследствие сочетания воздействия al Decarb и снижения ГАМК-ергической передачи, что приводит к увеличению соотношения возбуждающей и тормозной передачи в нервно-мышечных соединениях CL ELs и последующему параличу. Тем не менее, мутанты tomasin one on 43 и on 25 проявляют схожую чувствительность к Al Decarb в данной временной точке.

Несмотря на наличие различных причин гиперстимуляции мышц телостной стенки, экспериментатор не сможет определить лежащий в основе механизм гиперчувствительности, не установив предварительно природу вызывающих ее мутаций. Для данного видео мы вернулись к тем же червям дикого типа из предыдущего ролика спустя три часа воздействия aldecarb; на этом конечном этапе нашего анализа воздействия aldecarb должно быть отчетливо видно, что эти черви, несмотря на то что они относятся к дикому типу, либо полностью иммобилизованы, либо почти не двигаются. Сейчас эти черви фенотипически схожи с мутантами tom-1 и m-25, показанными через один час после воздействия aldecarb, предположительно потому, что возбуждающая холинергическая передача достигла сопоставимых уровней; в отличие от них, мутанты synap-brn-1 остаются значительно более подвижными через три часа воздействия aldecarb.

Этот результат согласуется с тем, что мутанты Synaptive Bren one, у которых отсутствуют нормальные уровни секреции нейромедиаторов, испытывают меньшую холинергическую стимуляцию мышц body wall, чем черви дикого типа, после воздействия идентичных уровней alde carb в этот период. Мутанты Point on four, характеризующиеся специфическим дефицитом холинергической передачи, должны проявлять чувствительность к Al Decarb, аналогичную чувствительности мутантов Synaptive Bren one. И наоборот, гиперчувствительные мутанты Tomasin one и O 25 остаются парализованными, подобно червям дикого типа.

Стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, что устойчивы к Al Decarb, могут пытаться сползти с чашки. В таком случае экспериментатор может нанести определенное количество пальмитиновой кислоты, которая служит физическим барьером для перемещения червей. По периметру чашек с Al Decarb мы наносили 25 µL раствора пальмитиновой кислоты в концентрации 10 mg/mL в этаноле.

На этом завершается описание парадигмы воздействия Al Decarb. Теперь я продемонстрирую парадигму воздействия Penta Lean Terazol. Кейлин Берри будет помогать нам в проведении анализов с использованием PTZ.

Подготовка червей для анализа с PTZ практически идентична подготовке червей для анализа альдегидного карбонила. Единственные существенные различия между этими двумя методами заключаются в следующем: в качестве растворителя для PTZ вместо 70% этанола используется DDH₂O.

Кроме того, поскольку мы часто высеваем более крупные объемы PTZ, чем ALDE carb, мы даем чашкам высохнуть в течение как минимум одного часа перед добавлением OP 50. С PTZ также может быть использована пальмитиновая кислота. Также важно отметить, что PTZ гораздо менее стабилен, чем alde carb, и должен храниться при температуре -20 °C.

Для начала анализа подсчитывайте количество эпилептических световых судорог у червей каждые 30 минут в течение одного часа. Рекомендуется распределять червей с разными типами судорог по отдельным категориям, таким как судороги всего тела, передние судороги (которые мы называем «кивками головы»), сочетание передних судорог с параличом мышц брюшной стенки (которые мы называем тонико-клоническими) или полный паралич тела (который мы называем тоническим). Судорогоподобная активность, наблюдаемая у червя справа, часто следует за тонико-клоническими судорогами, которые видны у червя слева (тоника).

Эпилептиформная активность может быть простым следствием мышечного утомления после повторяющихся тонико-клонических судорог. Однако наши неопубликованные данные указывают на то, что некоторые черви могут впадать в тоническое состояние при воздействии PTZ подобно параличу, вызванному декарбоксилированием, даже если ранее у них не наблюдалось тонико-клонических судорог. Здесь мы демонстрируем типичного червя-мутанта с нарушением синаптической передачи, ползущего в отсутствие PTZ — антагониста ГАМК-рецепторов и распространенного индуктора судорог, используемого в различных животных моделях судорог и эпилепсии.

Обратите внимание, что во время поиска пищи кончик или «нос» червя раскачивается из стороны в сторону. В этом видео мы демонстрируем другого червя из той же мутантной линии с нарушением синаптической передачи, которая использовалась в предыдущем видео. Заметьте, что этот червь, находящийся в присутствии 2,5 mg PTZ на 1 мл воды, в основном продолжает двигать головой из стороны в сторону во время поиска пищи.

Тем не менее этот червь периодически прекращает поисковое движение из стороны в сторону и вместо этого повторяющимися движениями толкает передний конец вперед. Наконец, следует рассмотреть червя с той же мутацией, что и у червей в двух предыдущих видео, в присутствии 10 mg PTZ на мл воды. Заметьте, что у этого червя поисковая активность из стороны в сторону снижена, а передний конец толкается вперед с большей частотой и интенсивностью, чем при более низкой концентрации PTZ.

Эти результаты демонстрируют дозозависимость действия PTZ, которую мы наблюдаем у всех мутантов синаптической передачи, чувствительных к PTZ. Важно отметить, что воздействия PTZ недостаточно для индуцирования эпилептиподобных судорог у червей дикого типа. Аналогично, мы пытались вызвать, но не наблюдали PTZ-индуцированные эпилептиподобные судороги у червей со специфическим дефицитом холинергической передачи, таких как on four, или с избыточной холинергической передачей, таких как tomasin one.

Таким образом, представляется возможным проводить дальнейшую характеристику мутантов синаптической передачи с резистентностью к альдегидкарбонилу, дифференцируя общий дефицит синаптической функции от специфического дефицита холинергической передачи на основе их относительной чувствительности к PTZ. Возможно, вызывает удивление тот факт, что мутант ONC 25 с выраженным снижением функции, у которого в тормозных моторных нейронах *C. elegans* не обнаруживается экспрессии GABA, не проявляет спонтанных эпилептических судорог, как показано на данном видео.

Мутант ONC 25 при воздействии PTZ в концентрации 10 мг/мл в воде проявляет выраженные тонико-клонические судороги, хотя на записи показаны только передние судороги с некоторыми движениями, которым предшествовали тонико-клонические судороги, связанные с ONC 25, и которые имитировали судороги мутантов synap Bren one. Следовательно, экспериментатору не следует полагать, что все ингибиторные ГАМК-мутанты будут демонстрировать тонико-клонические судороги или тесно связанную с ними тоническую эпилептиформную активность в присутствии PTZ, особенно учитывая вероятность получения гипоморфных аллелей мутантов.

Ранее мы продемонстрировали гиперчувствительность к alde carb и к PTZ у мутантов с нарушением тормозной ГАМК-передачи, а также только гиперчувствительность к alde carb при нормальной чувствительности к PTZ у мутантов с отсутствием отрицательной регуляции холинергической передачи. Возникает вопрос о том, как мутанты с потерей функции UNC-43 реагируют на PTZ, поскольку они также гиперчувствительны к Alda carb, как и другие наши мутанты с нарушением синаптической передачи. Мутанты по UNC-43 не проявляют явных эпилептиформных судорог в отсутствие PTZ, хотя у них наблюдаются редкие не повторяющиеся, но все же спонтанные сокращения всего тела; однако после воздействия 10 mg PTZ на mL воды мутанты с потерей функции UNC-43 демонстрируют выраженные повторяющиеся и дозозависимые судороги всего тела. На данный момент эти результаты неоднозначны, но, по-видимому, указывают на то, что UNC-43 не играет специфической роли в тормозной ГАМК-ергической передаче или играет роль только в отрицательной регуляции высвобождения нейромедиатора.

На примере нервной системы C. elegans мы только что продемонстрировали, как определять характеристики мутантов синаптической передачи CL elgan с помощью взаимодополняющих нейростимуляторов: альдекараба, ингибитора холинэстеразы, и PTZA, антагониста ГАМК-рецепторов. При использовании данной взаимодополняющей фармакологической парадигмы следует помнить, что степень чувствительности к одному нейростимулятору не позволяет предсказать степень чувствительности к другому. Применение тестов с альдекарабом должно помочь отличить ингибиторные ГАМК-мутанты, у которых наблюдается кивание головой (head bobbing) при воздействии PTZ, но которые гиперчувствительны к альдекарабу, от мутантов с общим дефицитом синаптической функции, у которых также наблюдается кивание головой при воздействии PTZ, но которые устойчивы к альдекарабу. Кроме того, следует учитывать, что ингибиторные ГАМК-мутанты проявляют кивание головой при воздействии PTZ, в то время как черви с отсутствием отрицательной регуляции холинергической передачи по фенотипу на PTZ выглядят как дикий тип.

Таким образом, анализ с использованием PTZ также может быть применен для разграничения этих классов мутантов синаптической передачи, которые в обоих случаях гиперчувствительны к Alde carb. Резюмируя, дополнительный подход с использованием анализов с PTZ и Alde carb должен позволить исследователю охарактеризовать мутантов синаптической передачи C elegant таким образом, который невозможен при использовании только одного из этих препаратов. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.