Осмотическое избежании в Caenorhabditis Элеганс: Synaptic функции двух генов, ортологов прав NRXN1 И NLGN1, В качестве кандидатов на аутизм

Здравствуйте, меня зовут Мануэль Руис Рубио, я представляю кафедру генетики Университета Кордовы, Испания. Мы используем C. elegans в качестве экспериментальной модели для изучения аутизма, используя преимущества полностью охарактеризованной нервной системы этого организма. Мы изучаем мутантов нематоды с дефектами в генах, участвующих в формировании нейронных синапсов и связанных с аутизмом.

Нейрексины и нейролигины представляют собой молекулы мембранной адгезии, присутствующие в синапсах. Голова C. elegans содержит амфиду — сенсорный орган нематоды, который опосредует реакции на различные стимулы, включая осмотическую силу. Амфида состоит из 12 сенсорных биполярных нейронов с ресничными дендритами и одного пресинаптического терминального аксона.

Два из этих нейронов, называемые ASHR и ASHL, особенно важны для функции осмотического сенсорного восприятия, обеспечивая обнаружение водорастворимых репеллентов с высокой осмотической силой. Мы демонстрируем метод с использованием кольца из 4M фруктозы для измерения осмотического избегания у мутантов C. elegans с синаптическими дефектами.

Чтобы оценить роль нейрексинов и нейролигинов в избегании высокой осмотической силы, мы описали различную реакцию мутантов C. elegans с дефектами в генах nrx-1 и nlg-1, используя метод, основанный на кольце из 4M раствора фруктозы. В день проведения опыта приготовьте 4M стоковый раствор фруктозы с 1% конго красного, полностью растворив его при комнатной температуре. Кольцо диаметром один сантиметр наносится в центр плотной среды на чашку с NGM.

Используйте 15 µL красного 4M раствора фруктозы. Дайте фруктозе впитаться в агар в течение примерно пяти минут; эксперимент следует проводить вслепую. Плашка с каждым штаммом, подлежащим тестированию, должна быть промаркирована вторым экспериментатором.

Анализ поведения (SA) проводится с использованием этих меток, которые не требуют предварительной подготовки. Когда эксперимент завершен, примерно за 24 часа до проведения анализа, необходимо отобрать личинок стадии L4 каждого генотипа и перенести их на чашку с NGM, содержащую бактерии e coli, и выдерживать при 20 °C до следующего дня. Эксперимент следует начинать с молодых взрослых особей.

Поместите отдельную особь каждого штамма внутрь круга покоя и наблюдайте за каждым животным, замеряя время его реакции на тактильный барьер. Для получения убедительных результатов следует использовать 10 животных каждого штамма и провести минимум три повторных эксперимента. Особи, шесть раз подряд избегающие красного кольца, классифицируются как нормальные.

Животные, покидающие кольцо менее чем за шесть попыток, считаются имеющими дефект чувствительности к осмосу; в каждом анализе необходимо использовать контрольный штамм SA Bristol, при этом два животных используются в качестве положительного контроля, так как они избегают барьера кольца. Контрольные штаммы реагируют перемещением назад при обнаружении осмотического барьера, состоящего из 4M фруктозы. Мутанты с дефицитом нейрорексинов демонстрируют аналогичное поведение в отношении осмотической силы данного типа.

Однако мутанты с дефицитом NEUR не смогли обнаружить этот осмотический барьер. Двойные мутанты с различными активными аллелями neur и nout восстановили фенотип дикого типа, реагируя на осмотическую силу. Для получения червей с подавленным экспрессией гена путем кормления с РНК-интерференцией изолируют колонии E. coli штамма HD 115, трансформированного вектором L4440, содержащим фрагмент, соответствующий целевому гену. Бактерии изолируют на чашки с LBA или среду с карбоникой на следующий день.

Выберите колонию бактерий и инокулируйте жидкую среду LV. Инкубируйте в течение примерно семи часов при перемешивании при 37 °C. Нанесите каплю данной культуры на чашку с NGM, содержащим карбонильный потолок и IPTG, и оставьте на ночь при комнатной температуре, чтобы бактерии выросли и началась индукция экспрессии фрагмента целевого гена.

Для РНК-интерференции необходимо использовать положительный и отрицательный контроли. Эксперименты по кормлению. Отрицательный контроль идентичен.

Штамм HT115, трансформированный вектором pL4-40. Положительные контроли — клетки HT115, трансформированные вектором pL4-40, содержащим последовательность гена 22. Нокдаун этого гена вызывает фенотип «shaking» (дрожание), который легко определить под стерильным микроскопом.

Первый день. Личинок на стадии L4 с чашек NGM с бактериями переносят на чашки с бактериями и инкубируют при 20 °C в течение 12 часов. Этот период является периодом голодания.

На следующий день перенесите молодых взрослых особей на чашку с инокулятом бактерий, экспрессирующих специфический целевой ген РНК-интерференции. Выдержите около 48 часов при 20 °C для получения потомства F1. Затем в течение следующих двух дней перенесите нескольких взрослых особей F1 на другую чашку с инокулятом тех же бактерий.

Отоберите и изолируйте молодых взрослых особей из потомства F2. Проведите оценку фенотипов штамма дикого типа Bristol N2, выращенного на бактериях OP50. Вектор L4440 был направлен в обратную сторону при пересечении осмотического барьера.

Штамм дикого типа Bristol и true white, которых кормили бактериями, экспрессирующими фрагмент гена nrx-1 из C. elegans, не смогли обнаружить кольцо из 4M растворов. Однако мутант с дефицитом nrx-1, неспособный определять осмотический барьер, восстановил эту способность при кормлении бактериями, экспрессирующими фрагмент гена nlg-1 из C. elegans. В данном видео мы демонстрируем простой метод, позволяющий изучать влияние генов, воздействующих на реакцию избегания осмоса у C. elegans.

Кольцо из раствора фруктозы с конго красным используется для анализа реакции червя на осмотическое давление. Мутанты с дефицитом нейролигина имеют нарушения в этой реакции, однако мутанты NU не имеют проблем с определением осмотического стресса, демонстрируя ответ, схожий со штаммом дикого типа. В данном видео показано, что штаммы двойных мутантов, несущие различные нокаутные аллели в генах nrx-1 и nlg-1, восстановили фенотип дикого типа, реагируя на осмотическое давление.

Эти наблюдения были подтверждены с помощью РНК-интерференции методом скармливания. Таким образом, способность штамма дикого типа распознавать осмотический барьер была нарушена при скармливании ему бактерий, экспрессирующих соответствующую последовательность гена ING. С другой стороны, мутанты с дефектом neur, которые не способны обнаруживать 4M раствор фруктозы, восстанавливали это поведение при скармливании им бактерий, экспрессирующих соответствующую последовательность гена NNU.

Результаты, представленные в данном эксперименте, указывают на то, что n seeing и neur могут быть задействованы в синаптических связях сенсорных нейронов нематоды, а также на то, что они взаимодействуют друг с другом таким образом, который влияет на синаптическую функцию. Итак, до свидания и удачи в ваших экспериментах.