Фазового контраста и дифференциальных помех контраста (DIC) микроскопии
6 августа 2008 г.
Этот протокол освещаются принципы и практические применения фазы и контраста дифференциальных помех (DIC) микроскопии
Световая микроскопия является одним из, если не самым важным инструментов в области биомедицинских исследований. В зависимости от целей исследования для визуализации образца могут потребоваться различные режимы освещения. В данном видео будут продемонстрированы два оптических режима освещения проходящим светом: фазово-контрастная микроскопия и дифференциально-интерференционный контраст (DIC).
Здравствуйте! Меня зовут Виктория Сан Фролик, я представляю центр оптической визуализации Медицинского центра Университета Техаса в Сан-Антонио. Сегодня я покажу вам, как правильно проводить исследование образцов с помощью фазово-контрастной и дифференциально-интерференционной микроскопии. Итак, приступим.
Стандартная микроскопия в светлом поле недостаточно эффективна для изучения прозрачных и бесцветных образцов. Фазово-контрастная микроскопия часто применяется для создания контраста при исследовании прозрачных, не поглощающих свет биологических объектов. Этот метод был разработан Цюрихом в 1942 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.
Фазово-контрастный микроскоп представляет собой световой микроскоп с transmitted light (проходящим светом), дополненный специальными фазово-контрастными объективами, содержащими фазовую пластину или кольцо, и конденсорным кольцом вместо диафрагмы. Кольцо обычно расположено в револьвере конденсора, и его размер необходимо подбирать в соответствии с используемым объективом. После настройки освещения по Кёлеру выберите подходящий фазовый объектив, а затем установите соответствующее фазовое кольцо в конденсоре.
После того как фазовое кольцо объектива и кольцо конденсора были правильно выровнены так, чтобы они были концентричны и перекрывались, можно приступить к наблюдению за образцом и правильной настройке фокуса. Давайте продемонстрируем, как выглядит фазовый контраст при просмотре через микроскоп. Перед вами срез печени крысы.
С использованием фазового контраста. Этот метод улучшает визуализацию биологического материала, изменяя контрастность: вместо различных оттенков серого используются оттенки от черного до белого. Однако вы заметите, что образцы окружены ореолом, который скрывает мелкие структурные особенности.
Этот ореол является артефактом освещения фазовым кольцом. Теперь вы заметите, что при переключении в режим светлого поля данный образец очень трудно рассматривать. При возврате к фазово-контрастному методу мы можем четко видеть структуру и форму клеток в ткани печени крысы, начиная с момента внедрения этого метода в конце 1960-х годов.
Микроскопия в режиме дифференциального интерференционного контраста (DIC) широко применяется в биомедицинских исследованиях, поскольку она позволяет получать изображения тонких структур с высоким разрешением за счет усиления контраста на границах раздела фаз, при этом формируемое изображение представляет собой очень тонкий оптический срез. Фактически, способность метода DIC создавать оптические срезы сделала его полезным режимом освещения проходящим светом в сочетании с конфокальной микроскопией. Микроскоп DIC представляет собой световой микроскоп в режиме светлого поля с добавлением следующих элементов: поляризатора между источником света и конденсором.
Разделительная призма ДИХ-пучка в части конденсатора, объединяющая призма ДИХ-пучка непосредственно за объективом и анализатор в бесконечном пространстве перед двумя линзами. Чтобы добиться наилучших характеристик оптики ДИХ, важно сначала настроить световой микроскоп на освещение по Кёлеру, а затем поместить элементы ДИХ в оптический путь. Свет от источника проходит через поляризатор, после чего разделяется первой призмой.
Эти парные лучи проходят близко друг к другу. Если оба луча проходят через один и тот же материал образца, то при их повторном объединении второй призмой они не интерферируют друг с другом и, следовательно, выглядят серыми. Однако на краю структуры один луч из пары проходит через материал, отличный от материала, через который проходит второй луч, и подвергается изменению.
Когда эти лучи вновь соединяются второй призмой, возникает либо конструктивная интерференция, создающая светлое пятно, либо деструктивная, создающая темное пятно. Рассмотрим диатомовые водоросли при дифференциальном фазовом контрасте (DIC). Вы заметите, что мелкие детали структуры диатомей отчетливо видны.
Однако при удалении оптики дифференциального интерференционного контраста (DIC) эти детали исчезают. Контраст по всему образцу распределяется так, что одна сторона выглядит светлой, а другая — более темной. Это создает впечатление рельефности, но на самом деле является иллюзией.
Направление эффекта отбрасываемой тени можно изменить, повернув поляризатор через точку пересечения до достижения противоположного контраста. Мы только что рассмотрели оптические режимы фазового контраста и дифференциального интерференционного контраста (DIC). Напоминаем, что подавление фазового контраста делает контрастные объекты более светлыми (от черного к белому), что полезно для наблюдения за бесцветными и прозрачными образцами.
Дифференциально-интерференционный контраст (DIC) также создает контраст в образце. Это достигается путем получения изображения высокого разрешения тонкого оптического среза. На этом всё.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших микроскопических исследованиях.
Обзор
В данном протоколе освещаются принципы и практическое применение фазово-контрастной микроскопии и микроскопии с дифференциальным фазовым контрастом (DIC). Эти методы улучшают визуализацию прозрачных и бесцветных биологических образцов, что делает их незаменимыми инструментами в биомедицинских исследованиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинские исследования
- Методы микроскопии
- Оптическая визуализация
Теоретические сведения
- Световая микроскопия имеет решающее значение для изучения биологических образцов.
- Фазово-контрастная микроскопия повышает контрастность прозрачных образцов.
- Дифференциально-интерференционная контрастная (ДИК) микроскопия позволяет получать изображения тонких структур с высоким разрешением.
- Оба метода необходимы для эффективного анализа образцов.
Цель исследования
- Продемонстрировать применение фазово-контрастной микроскопии и дифференциального интерференционного контраста (ДИК).
- Объяснить принципы настройки и юстировки методов микроскопии.
- Осветить преимущества данных методов при исследовании биологических материалов.
Используемые методы
- Настройка освещения по Кёлеру для оптимального распределения света.
- Использование фазово-контрастных объективов и фазовых колец.
- Применение оптики DIC, включая поляризаторы и призмы-делители луча.
- Сравнение видимости образцов при использовании различных методов микроскопии.
Основные результаты
- Фазово-контрастная микроскопия позволяет визуализировать клеточные структуры в прозрачных образцах.
- Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) улучшает детализацию мелких структур и создает топографический эффект.
- Оба метода значительно повышают четкость изображения биологических образцов.
- Рассматриваются и объясняются такие артефакты, как гало при фазово-контрастной микроскопии.
Выводы
- Фазово-контрастная микроскопия эффективна для визуализации бесцветных и прозрачных образцов.
- Дифференциально-интерференционный контраст (DIC) обеспечивает получение изображений тонких структур с высоким разрешением.
- Оба метода представляют большую ценность для развития исследований в области биологических наук.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Фазово-контрастная микроскопия и дифференциальный интерференционный контраст (DIC) позволяют визуализировать прозрачные, не поглощающие свет биологические образцы, что востребовано в рабочих процессах на ранних этапах исследований, где требуется безмаркерная визуализация. Эти методы способствуют снижению технических рисков, раскрывая структурные детали и функциональную морфологию живых клеток и тканей без необходимости фиксации или окрашивания. Их интеграция в процессы поиска новых мишеней повышает достоверность валидации за счет возможности прямого наблюдения фенотипических ответов и клеточной архитектуры в условиях, близких к физиологическим.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает безмаркерное наблюдение за прозрачными образцами, такими как живые клетки и срезы тканей, для оценки морфологических изменений, связанных с модуляцией мишени.
- Операционная ценность: позволяет проводить быстрый скрининг клеточных фенотипов без необходимости использования флуоресцентных меток или химической фиксации, что сокращает время подготовки анализа.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность гипотез относительно мишени, позволяя напрямую визуализировать структурные и функциональные фенотипы в системах, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает высококонтрастную визуализацию без использования меток, которая подходит для разработки фенотипических анализов в тех случаях, когда прозрачность образцов скрывает детали при освещении в светлом поле.
- Практическая ценность: позволяет стандартизировать условия визуализации с помощью освещения по Кёлеру и точной настройки фазовых пластин или DIC-призм, что повышает воспроизводимость результатов между сериями экспериментов.
- Масштабируемость: совместимость с форматами многолуночных планшетов при интеграции в автоматизированные системы микроскопии, что позволяет проводить скрининговые кампании со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает этапы фундаментальных исследований и доклинических испытаний, обеспечивая единообразную визуализацию первичных клеток, эксплантатов и моделей эмбрионов на всех этапах рабочих процессов.
- Снижение механистических рисков: Позволяет выявить мелкие структурные детали на границах разделения тканей, что помогает прояснить механизмы действия в сложных биологических системах.
- Системы, имеющие значение для изучения заболеваний: Применимо к толстым образцам, включая срезы тканей, яйлетки и эмбрионы, что позволяет проводить оценку в физиологически сложных моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Фазово-контрастная микроскопия и микроскопия дифференциального интерференционного контраста (DIC) выступают в качестве базовых технологий в непрерывном процессе научных открытий, обеспечивая проверку гипотез в фундаментальной биологии, подготовку анализов для скрининга и морфологический анализ в трансляционных исследованиях.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез, позволяя напрямую наблюдать клеточные ответы на воздействующие факторы в прозрачных неокрашенных образцах.
- Скрининг: способствует разработке методов анализа за счет воспроизводимой высококонтрастной визуализации безметочных образцов, что снижает вариабельность фенотипических показателей.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения интенсивности и контраста на структурных границах, обеспечивая объективное сравнение экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность за счет единообразной визуализации первичных тканей и эксплантатов на всех этапах — от фундаментальных открытий до доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой многократно используемый ресурс визуализации для различных отделений, что сокращает избыточность при распределении ресурсов микроскопии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, выявляя тонкие структурные детали и топологические особенности живых неокрашенных образцов.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации за счет четко определенных процедур юстировки фазовых кольцевых диафрагм и оптики DIC, что повышает воспроизводимость ежедневных исследований.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшего развития проекта («go/no-go»), повышая достоверность фенотипических наблюдений и тем самым снижая процент потерь на поздних этапах из-за непредвиденной биологической сложности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе прямых безмаркерных фенотипических доказательств, полученных в системах, релевантных для изучаемого заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области юстировки оптики, включая настройку освещения по Кёлеру и точное центрирование фазовых пластин или призм DIC.
- Зависимость от специализированного оборудования: фазово-контрастных объективов с фазовыми кольцами, кольцами конденсора, поляризаторов, светоделительных и объединяющих пучки призм, а также анализаторов.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов освещения и юстировки для обеспечения воспроизводимости результатов разными пользователями и в разных центрах.
- При адаптации метода следует учитывать согласование показателей преломления и толщину образца, которые влияют на качество сечения при DIC и появление артефактов «ореола» при фазовом контрасте.
- Практические ограничения включают артефакты «ореола» в фазовом контрасте, которые могут скрывать тонкие структуры, и эффект направленной тени в DIC, представляющий собой оптическую иллюзию, не отражающую реальный рельеф поверхности.
