Давление полировки Пипетки для улучшения Патч-зажим Запись
22 октября 2008 г.
Это руководство к изменению формы из стекла микропипетки. В частности, с помощью тепла и давления воздуха конус расширяется без увеличения наконечник открытие, что приводит к снижению сопротивления пипетки. Это очень важно для получения низких записи шума из мелких клеток, но полезно во многих приложениях.
Данная процедура начинается с размещения наконечника пипетки рядом с полирующей нитью при 100-кратном увеличении. Затем включите подачу воздуха и нагрев. Нить.
Кончик пипетки расширится, образуя затупленный наконечник. Выключите нагрев, чтобы уменьшить диаметр отверстия наконечника. Снова выключите подачу давления и нагрев.
Здравствуйте, я Брэндон Джонсон из лаборатории доктора Мириам Гудман с кафедры молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета. Сегодня мы продемонстрируем процедуру полировки патч-пипеток под давлением. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения ионных каналов и мембранных патчей нейронов *C. elegans*.
Итак, приступим. Подготовьте набор из шести-десяти патч-пипеток. Для получения дополнительной информации обратитесь к местному специалисту или просмотрите наше видео по изготовлению патч-пипеток и острых электродов с помощью программируемого пуллера.
Для начала процедуры установите давление в линии сжатого воздуха примерно на 40 PS.I, затем подключите линию сжатого воздуха к четырехходовому регулирующему клапану. Подсоедините отрезок пластиковой трубки к четырехходовому клапану, а к свободному концу трубки прикрепите держатель для пипеток высокого давления. Для выполнения полировки используйте установку с микрогорном.
Мы используем комплект Ccpm two от компании LA Scientific. Данная установка оснащена держателем пипетки высокого давления, платиновым нагревательным элементом, управляемым ножной педалью, и микроскопом, оборудованным объективами с малым и большим увеличением (10x и 100x) и большим рабочим расстоянием. Такие объективы идеальны, так как в ходе протокола крайне важно иметь возможность наблюдать за отверстием пипетки.
Затем убедитесь, что выпускной клапан давления находится в выключенном положении. После этого установите пипетку в держатель для пипеток и затяните соединение пальцами до упора в целях обеспечения безопасности в лаборатории. Убедитесь, что пипетка надежно зафиксирована в держателе.
В противном случае из-за давления воздуха пипетка будет вытолкнута из держателя. В качестве дополнительного этапа вы можете покрыть пипетку гидрофобным изолятором, например воском, чтобы уменьшить емкость и улучшить характеристики шума. Теперь поместите пипетку в держатель в позицию микрокузницы (micro forge) и установите держатель пипетки на предметный столик микроскопа так, чтобы и кончик, и полировальная нить были видны при малом 10-кратном увеличении микрокузницы.
Подведите наконечник примерно на 50 микрон к полировальной нити, затем переключитесь на объектив 100 с большой апертурой; при этом и наконечник пипетки, и полировальная нить должны находиться в фокусе и в поле зрения. Если это не так, отрегулируйте высоту нити. Поскольку положение пипетки изменить нельзя, наконечник пипетки и нить должны располагаться по противоположным сторонам поля зрения.
Избегайте расположения наконечника пипетки слишком близко к нити, так как при нагревании она расширяется и может задеть пипетку. После того как наконечник и нить будут правильно расположены, поверните клапан, чтобы направить сжатый воздух в пипетку, и нагревайте наконечник до тех пор, пока конус за наконечником не начнет раздуваться. Прекратите нагрев до того, как раздувание наконечника станет слишком сильным.
Для определения подходящего расстояния, температуры и времени, необходимых для получения желаемой формы, требуются предварительные эксперименты. В качестве дополнительного этапа вы можете отполировать кончик без приложения давления, чтобы уменьшить диаметр отверстия кончика. Также имейте в виду, что эти этапы полировки можно повторять для достижения оптимального результата.
Отрегулируйте форму и размеры наконечника пипетки. После завершения полировки отключите подачу давления и направьте наконечник пипетки в безопасную сторону.
Извлеките пипетку и поместите ее в чистый контейнер для хранения, чтобы защитить ее от пыли. В целях безопасности в лаборатории обязательно отключите давление перед извлечением пипетки. В противном случае она может вылететь из держателя для пипеток.
Мы только что продемонстрировали вам способ полировки пипеток под давлением для улучшения качества записей методом патч-клампа. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости покрытия полировочной спирали стеклом с высокой температурой плавления, чтобы минимизировать осаждение паров металла на пипетках, а также соблюдать осторожность, когда пипетки подвергаются воздействию сжатого воздуха.
Убедитесь, что пипетка надежно зафиксирована в держателе, и выключите подачу воздуха перед тем, как извлечь пипетку из держателя. На этом всё. Спасибо за просмотр.
Желаем успехов в проведении полировки под давлением и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном руководстве подробно описывается модификация формы стеклянных микропипеток с помощью нагрева и давления воздуха. Этот процесс позволяет расширить конус, не увеличивая диаметр отверстия кончика, что крайне важно для получения записей с низким уровнем шума при работе с малыми клетками.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Изготовление микропипеток
Теоретические основы
- Стеклянные микропипетки являются важнейшими инструментами при проведении электрофизиологических записей.
- Для получения высококачественных записей необходимо низкое сопротивление пипетки.
- Изменение формы пипетки может улучшить ее эффективность в различных областях применения.
- Данный метод особенно полезен при записи сигналов с малых клеток.
Цель исследования
- Предложить метод формирования стеклянных микропипеток.
- Снизить сопротивление пипетки без увеличения диаметра отверстия наконечника.
- Повысить качество записей от малых клеток.
Используемые методы
- Позиционирование кончика пипетки рядом с полировальной нитью при большом увеличении.
- Подача давления воздуха и нагрев для расширения кончика пипетки.
- Отключение нагрева для получения меньшего отверстия кончика.
- Заключительная регулировка путем отключения давления и нагрева.
Основные результаты
- Кончик пипетки можно эффективно переформовать в тупую форму.
- Достигается более низкое сопротивление без увеличения размера кончика.
- Данный метод повышает качество регистрации сигналов из малых клеток.
- Продемонстрирован практический подход к модификации микропипетки.
Выводы
- Изготовление стеклянных микропипеток является ценным методом в нейробиологических исследованиях.
- Улучшенная конструкция пипетки способствует повышению качества данных.
- Данный метод может быть применен в различных электрофизиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Полировка пипеток под давлением снижает электрическое сопротивление при записях методом патч-клампа без изменения диаметра кончика, что позволяет с более высокой точностью измерять ионные каналы в небольших популяциях нейронов. Это техническое улучшение способствует валидации мишеней при поиске новых нейротропных препаратов за счет повышения соотношения сигнал/шум в электрофизиологических анализах. Повышение качества записи увеличивает прогностическую достоверность ранних механистических исследований возбудимости нейронов и синаптической функции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции ионных каналов в нейронах малого диаметра, которые имеют решающее значение для изучения мишеней при нейропатической боли и эпилепсии.
- Практическая ценность: снижает вариативность при записях одиночных каналов за счет минимизации шума, вызванного пипеткой.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает создание стандартизированной геометрии пипеток для получения воспроизводимых результатов при электрофизиологическом скрининге.
- Практическая ценность: Совместимость как с мягким, так и с жестким стеклом микропипеток, что позволяет гибко проектировать анализы для различных классов мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает применение метода локальной фиксации потенциала с перфорацией мембраны за счет создания тупых кончиков пипеток, что увеличивает образование мембранных выпячиваний при использовании антибиотиков-перфорантов.
- Практическая ценность: Увеличивает продолжительность регистрации в первичных культурах нейронов, повышая производительность исследований по оптимизации соединений-лидеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, где электрофизиологическое фенотипирование служит основой для выбора мишени и профилирования соединений-лидеров.
- Биология открытий: обеспечивает функциональную валидацию мишеней ионных каналов в релевантных для заболеваний нейрональных моделях.
- Скрининг: предоставляет пипетки с низким сопротивлением для высокоточного скрининга соединений на платформах патч-кламп.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения тока и проводимости с повышенной стабильностью сигнала.
- Трансляционные исследования: облегчают проведение лонгитюдных записей в острых срезах и культивируемых нейронах для фармакокинетического и фармакодинамического моделирования.
- Корпоративное использование: требует только модернизации микрокузницы, что делает этот метод масштабируемым и недорогим способом совершенствования существующей инфраструктуры электрофизиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет получения более четких электрофизиологических фенотипов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость анализа между различными центрами и операторами за счет стандартизации геометрии пипеток.
- Стратегическая ценность: Снижает количество ложноотрицательных результатов при скрининге ионных каналов за счет минимизации технического шума.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении (go/no-go) доклинических программ, направленных на изучение возбудимости нейронов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микропипетками и знания в области электрофизиологии.
- Необходим микрофорж с клапаном высокого давления, нагревательной нитью и оптикой с увеличением.
- Требуется стандартизация параметров давления, нагрева и времени для всех пользователей.
- Необходимо учитывать различия в типе стекла (натрий-кальциевое по сравнению с боросиликатным) при полировке.
- Возможности ограничены необходимостью ручного позиционирования кончика и навыками оператора для предотвращения избыточного расширения.
