Создание Patch-пипетки и Sharp Электроды с программируемой Puller

Стеклянные капиллярные пипетки стали повсеместными в лабораториях для использования в самых разных методах, таких как электропорация одиночных клеток, микроинъекция ДНК и электрофизиология методом патч-клампа. Для подготовки стеклянных капиллярных электродов для метода патч-клампа используется вытягивание силикатного стекла на программируемом пуллере. Кончики электродов покрывают воском, затем подвергают огневой полировке и хранят для последующего использования. Здравствуйте, я Мириам Гудман с кафедры молекулярной и клеточной физиологии Стэнфордского университета.

В этом видео я продемонстрирую, как изготовить пипетки для патч-клампа и острые электроды для электрофизиологии. Стеклянные микроэлектроды, также называемые пипетками, на протяжении десятилетий являются основным инструментом электрофизиологии. Сегодня такие пипетки изготавливают из стеклянных капилляров с помощью программируемого пуллера.

Итак, приступим. Для изготовления пипеток для патч-клампа мы используем стеклянные капилляры Sutter Borosilicate, которые должны быть чистыми и очищенными от пыли, а также микроэлектродный пуллер Sutter P-97 с системой оплавления. «Кулинарная книга по пипеткам» (Pipette Cookbook) от Sutter является отличным справочным руководством для разработки подходящих программ вытягивания.

Для начала поднимите защитную крышку на пуллере. Затем возьмите одну стеклянную капиллярную трубку из коробки. Обязательно закройте крышку, чтобы минимизировать накопление пыли.

Затем одной рукой вставьте капилляр в паз с одной стороны нити, слегка затянув зажим. На данном этапе зажим должен быть затянут достаточно плотно, чтобы трубка не выпала, но достаточно свободно, чтобы ее можно было задвинуть в паз. Теперь отпустите подпружиненный металлический стопор с той же стороны.

Затем большим и указательным пальцами захватите металлические язычки, прикрепленные к нижней части обоих держателей. Отпустите второй подпружиненный металлический стопор. Стяните держатели максимально близко друг к другу и удерживайте их одной рукой.

Затем просуньте пробирку через кожух нити накаливания в паз держателя с другой стороны. Избегайте давления стекла на нагревательную нить. Затяните зажимы с обеих сторон.

Они должны быть затянуты достаточно плотно, чтобы зафиксировать кассеты, но не слишком сильно, чтобы не раздавить стекло. Теперь закройте защитную крышку и нажмите зеленую кнопку. Пипетки с marked pole для регистрации патч-клампа изготавливаются с использованием пятиступенчатой программы вытягивания с постепенным снижением температуры и скорости на каждом этапе и формированием небольшого кончика на финальном этапе.

В данной программе используются тепло и гравитация. Процедура изготовления острых электродов очень похожа, но в этом случае мы используем тонкий стеклянный капилляр от Warner Instruments с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,78 мм. Мы также применяем программу вытягивания, в которой по завершении циклов нагрева и воздействия гравитации задействуется мотор.

Поднимите защитную крышку, ослабьте оба зажима и извлеките готовую пипетку. Затем поместите пипетки в рабочий бокс. Такой бокс можно изготовить, приклеив полоску пенопласта к штативу пластикового бокса для наконечников, а затем прорезав в пенопласте от шести до восьми прорезей.

Вставьте пипетки в прорези. Когда коробка будет заполнена извлеченными пипетками, переходите к этапу огневого полирования для обработки пипеток. Перед началом огневого полирования подготовьте установку с микрогорном, оснащенную платиновой нагревательной нитью с управлением с помощью ножной педали.

Сначала покройте пипетку стоматологическим воском, чтобы уменьшить емкость и улучшить шумовые характеристики. Для этого держите рядом небольшой запас расплавленного воска. Подавайте давление воздуха с задней части пипетки, чтобы воск не попал в кончик.

Затем ненадолго погрузите кончик в жидкий воск. После этого извлеките его. Поместите пипетку в полировальный аппарат и подведите кончик на расстояние приблизительно 50 microns от нити.

Учитывайте, что при нагревании нить расширяется. Подайте короткий тепловой импульс продолжительностью одной или двух секунд, чтобы удалить воск с кончика пипетки и разгладить стекло. Осмотрите кончики пипеток под микроскопом, чтобы определить диаметр отверстия и гладкость поверхности.

Для стандартных записей методом патч-кламп диаметр отверстия кончика должен составлять от one до three microns; кончики с шероховатостями, неровностями или неправильной формой следует отбраковать. Поместите готовую пипетку в рабочий бокс, обязательно закрыв крышку для защиты пипеток от пыли; повторите процедуру до получения 10 подходящих пипеток. Я только что продемонстрировал вам способ изготовления пипеток для патч-клампа и микроэлектродов с острым кончиком с помощью программируемого пуллера.

Та же процедура может быть использована для изготовления различных стеклянных инструментов, включая инъекционные иглы для достижения оптимальных результатов при локальной фиксации потенциала (patch clamp). Важно помнить, что вытягивание новых безпыльных пипеток следует проводить в день эксперимента, а их полировку — не позднее чем за час до начала работ. Также необходимо визуально убедиться, что пипетки гладкие и отполированные.

Обязательно посмотрите наше другое видео, в котором демонстрируется способ проведения локальной фиксации потенциала (patch clamp) ионных каналов, экспрессированных в ооцитах Xenopus. На этом всё. Теперь вы эксперт по работе с пипетками. Желаем удачи в ваших экспериментах.