Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

Joof larva nöromüsküler bileşkelelerinden stabil elektrofizyolojik kayıtlar elde etmek için; öncelikle, kayıt öncesinde gövde duvarını, kasları ve sinir sistemini açığa çıkarmak amacıyla bir larvayı dikkatlice diseke edin. Merkezi sinir sisteminin (MSS) tabanındaki aksonlar, ventral gangliyonun posteriorundan kesilir.

Ardından, kayıt elektrodu ilgili kasın üzerine ve stimülasyon elektrodu ise innervasyon yapan motor nöronların yakınına yerleştirilir. Motor nöronların kesilmiş aksonları stimülasyon pipetinin içine çekilir. Böylece eksitatör bileşke potansiyeller kaydedilebilir.

Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Fizyoloji ve Hücresel Biyofizik Bölümü'ndeki McCabe Laboratuvarı'ndan Wendy MLA. Bugün size GE lavrasının nöromüsküler bileşkesindeki sinaptik iletimi ölçmek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Sinaptik fizyolojiyi ve nöroiletimi incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Deneye başlamak için, gövde duvarını açığa çıkarmak amacıyla gezen üçüncü evre ve yıldız larvalarını diske edin. Bu protokol, kısa diseksiyon iğneleri kullanılarak elektrofizyolojik deneyler için modifiye edilmiştir.

Bunlar yaklaşık iki ila dört milimetre uzunluğundadır ve deney sırasında mikroskop objektifine veya elektrotlara çarpma olasılıkları daha düşüktür. Vücut duvarını açtıktan sonra, CNS'yi tutmak ve hafifçe kaldırmak için pens kullanın. Ardından periferik sinir motor aksonlarını kesin ve beyni çıkarın.

Beyni çıkardıktan sonra, diseksiyon hazırlığını 1 mM kalsiyum içeren HL 3.1 tamponu ile iki kez yıkayın. Diseksiyon tamamlandığına göre, larva kas hücrelerinden hücre içi kayıtlar alınabilir. Diseksiyon plağını elektrofizyoloji mikroskobuna yerleştirin ve hazırlığı kalsiyum eklenmiş HL 3.1 tamponuna daldırın.

Ardından, banyo elektrodunu çözeltiyle temas edecek şekilde sabitleyin. Emme elektrodu, kası innerve eden periferik sinirleri stimüle etmek için kullanılır. Hücre içi elektrot kasa yerleştirilirken oluşabilecek vibrasyonları önlemek için, emme elektrodunu önce kaba yerleştirin.

Elektrot kaba yerleştirildikten sonra, kas altı boyunca uzanan motor nörona yakın bir konuma getirin. Üçüncü abdominal segmentte, kesilen sinir cam pipetin içine girene kadar hafif vakum uygulayın. Vakum uygularken sinirleri germemeye dikkat edin.

Pipeti, kasa temas etmeyecek şekilde hafifçe kaldırın. Ardından, kesilmiş sinir liflerini çekmeyecek şekilde konumlandırın. Vakum elektrodu yerleştirildikten sonra, hücre içi kayıtlar için kayıt elektrodunu konumlandırın.

Üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş keskin bir mikro elektrot kullanın. Kayıt elektrodunu altıncı kasın merkezinin üzerine yerleştirin. Giriş ofsetini, banyo çözeltisi için sıfır okuyacak şekilde ayarlayın.

Elektrodu yavaşça indirin ve yüksek optik büyütme altında, kas yüzeyine değene kadar kasa yaklaştırın. Kasın penetre edildiğini doğrulamak için osiloskopu izleyin. Dinlenme membran potansiyeli en az negatif 60 millivolt olmalıdır.

Sporadik minyatür plak potansiyeli şu anda görünür olmalıdır. Kayıt elektrodu yerleştirildikten sonra, hücrelerin bir dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Kayıtlara başlamadan önce, membran potansiyelindeki değişiklikleri tespit etmek için bir axon HS two, bir kafa evresi ve bir axle clamp two B amplifikatörü kullanın.

Axle clamp two B, sinyali dijitalleştiren digit data 1322 A üzerinden P clamp yazılımını çalıştıran bir bilgisayara bağlıdır. Membran potansiyelini bir PC'ye kaydedin. Clamp X yazılımı ile, eksitatör membran potansiyelleri veya EPSP'ler oluşturmak için motor aksona stimülasyon uygulayın.

ej'ler oluşturulduktan sonra, stimulus sinapsı olmadan üç dakikalık bir süre boyunca minyatür ej'leri kaydedin. İzleri analiz etmek ve mini EJP amplitüdü ile frekansını belirlemek için Soft mini analiz yazılımı kullanılabilir. ej'leri oluşturmak için.

Bir motor nöron programının kopmuş ucünü uyarmak için sekizli ana darbe üreteci kullanın. Üretecin 0,3 milisaniyelik kare voltaj darbeleri iletmesi programlanır. Sinaptik toparlanmaya izin vermek için uyaranlar arasında beş saniyelik bir aralık süresi bırakın.

NMJ'de her bir kastan en az 10 uyarılmış potansiyel kaydedin ve amplitüdlerin ortalamasını alın. Bu şekil, uyarılmış EJP yanıtları ve spontan mini EJP'ler ile birlikte vahşi tip sal larvasının altıncı kasından kaydedilen tipik bir izi göstermektedir. Drosophila larvasının nöromüsküler bileşkesinden nasıl syt potansiyeller kaydedileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, diseksiyonu üç ila 10 dakika içinde tamamlamayı ve hücreler henüz sağlıklı ve duyarlıyken elektrofizyolojik kayıtlara hemen başlamayı unutmamak önemlidir.

Diseksiyon çok uzun sürerse, kas hücrelerinin dinlenme membran potansiyeli -60 millivolt'tan daha düşük olacaktır ve bu değer kayıt almak için çok düşüktür. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.