Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Bu prosedür, all-trans retinol içeren besiyerinde uygun genotipe sahip üçüncü instar drosophila larvalarının yetiştirilmesiyle başlar. Her larva, baş ve kuyruk kısımlarından iğnelenerek sabitlenir.

Ardından FLA düzleştirilir. Ritmik motor aktiviteyi durdurmak için beyin ve posterior sinirler kesilir. Sonrasında, kontrol kutulu mavi LED ışık kaynağı ayarlanır ve preparata odaklanır.

Son olarak, altıncı kası delmek için keskin bir elektrot kullanın. Ardından bir voltaj kaynağı ile ışık darbeleri uygulayın. Merhaba, ben Dr. Leslie Griffith'in laboratuvarından, Brandeis Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Nicholas Marstein.

Merhaba, ben de Griffith Laboratuvarı'ndan Stefan Pulver. Bugün size, drosophila larvasının nöromüsküler ekleminde, channel root absent two ile sinaptik potansiyellerin uyandırılması prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda drosophila sinaptik fizyolojisini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Ayrıca bunu öğrencilere sinaptik fizyolojiyi öğretmek ve öğretim laboratuvarlarında kullanıyoruz. Hadi başlayalım. Bu protokole başlamak için, UAS channel redsin two ve 3 7, 1 gal four sinek hatlarını standart sinek besiyeri içeren ayrı şişelerde muhafaza edin.

3 7, 1 gal, dört sinek hattından bakireleri ve UAS channel redsin iki hattından erkekleri toplayın. Ardından, 1 millimolar all-trans retinol veya ATR ile karıştırılmış sinek besiyeri hazırlayın. Bunun için standart sinek besiyerini mikrodalga fırında yaklaşık bir dakika boyunca eritin.

Besiyeri eridikten sonra, yaklaşık 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın ve ardından her 10 mililitre sinek besiyeri için %100 etanol içinde 100 milimolar a TR'den 100 mikrolitre ekleyin. a TR içeren besiyerli tüpler hazır olduğunda, toplanan erkek ve dişileri her tüpe yerleştirin. Sineklerin çiftleşmesi ve yumurta bırakması için tüpleri 22 ila 25 derece santigrat sıcaklıktaki karanlık bir alana yerleştirin ve üçüncü instar larvalar görünene kadar dört ila beş gün bekleyin.

Bu noktada, yetişkin sinekleri imha edebilirsiniz. Artık elektrofizyoloji düzeneğinin kurulumuna geçmeye hazırız. Herhangi bir diseksiyon mikroskobu okülerini, ısı emiciye sahip mavi bir LED ışık kaynağına takın.

Oküler ve LED ışık kaynağını sabitlemek için bir destek çubuğu ve kıskaç kullanarak manyetik tabanı tutturun. Manyetik tabanı elektrofizyoloji düzeneğinin hava tablası üzerine yerleştirin. Ardından, ışık kaynağını bir kontrol devresine bağlayın ve ardından kontrol devresini harici bir voltaj kaynağına bağlayın.

AD Instruments tarafından üretilen power lab elektrofizyoloji veri toplama sisteminden gelen voltaj çıkışını kullanıyoruz. Voltaj kaynağına bağlandıktan sonra, mavi ışığı aktive etmek için kontrol devresine bir ila beş voltluk darbeler verin; mavi ışık demeti larva diseksiyonunun yapılacağı alana odaklanana kadar manyetik tabanı ve ışık kaynağını ayarlayın. Gerekli ayarlamaları yaptıktan sonra, larva diseksiyonuna geçmeye hazırız.

Diseksiyona başlamak için, agar kaplı bir kabın tabanına altı adet 0,1 milimetre boyutunda pin yerleştirin. Üçüncü evre yıldız larvalarını besiyerinden çıkarıp herhangi bir plastik Petri kabına koyun. Larvalara yapışmış olan besinleri temizlemek için larvaları salin ile durulayın.

Ardından larvaları, çıkarılan pinlerin yanındaki diseksiyon kabına yerleştirin ve kabı yarıya kadar salinle doldurun. Şimdi larvaları, hayvanın dorsal yüzeyi boyunca uzanan iki gümüşi tüpü görebileceğiniz şekilde konumlandırın. Bu gümüşi tüpler trakealardır.

Büyük bir iğneyi, trake tüplerinin arasından doğrudan kuyruk kısmına yerleştirin. Larvayı aşağıya doğru bastırın ve ikinci bir büyük iğneyi baş kısmına yerleştirin. İğne yerleştirilirken gövdenin boyuna olarak gerildiğinden emin olun.

Kuyruğun yakınına makasla küçük bir insizyon yapın. İnsizyonu gövde boyunca yukarıya doğru sürdürün. Ventral sinirleri ve/veya gövde duvarı kaslarını kesmemek için makas uçlarının yukarıda kaldığından emin olun.

Hayvanların dört köşesine dört adet iğne yerleştirin. Şimdi orta kısmı açın. Hayvanı fileto haline getirmek için iğneleri diseksiyon kabına sabitleyin.

Hazırlığı, pens ve makas kullanılarak çalışılacak şekilde sabitleyin. Hayvanın sindirim organlarını, trakeasını ve yağ cisimlerini çıkarın. Hazırlığı salin ile durulayın.

Durulama işleminden sonra, mikro makas kullanarak preparatın frontal loblarını ve ventral gangliyonunu bulun. Frontal lobların hemen arkasındaki ventral gangliyonu dikkatlice kesin. Diseksiyon tamamlandığında, mavi ışık stimülasyonuna ve kas kaydına geçin.

Kas kaydı gerçekleştirmek için, 10 ila 20 mega ohm dirençli bir elektrot çekin. Elektronik bir elektrot çekici kullanarak, çekilen elektrodu üç molar KCL ile doldurun. Doldurulan elektrodu elektrot tutucuya yerleştirin.

Şimdi larva hazırlığını düzenek üzerindeki bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Mavi ışığı, diseke edilmiş hazırlık ışık demetinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın. Bir mikromanipülatör kullanarak larvanın herhangi bir vücut duvarı segmentindeki altıncı kası veya M6'yı tanımlayın, elektrodu dikkatlice M6'ya yerleştirin ve kasın hızlı hiperpolarizasyonunu gözlemleyin.

Dinlenim membran potansiyelleri -30 mV ile -70 mV arasında olmalıdır. Elektrot uygun şekilde yerleştirildikten sonra, kontrol devresine 20 ila 100 ms'lik voltaj darbeleri uygulayın. Kontrol devresine verilen voltajı kademeli olarak artırın.

Kas hücresindeki uyarıcı kavşak potansiyellerini izleyin. Burada, kısa ışık darbeleriyle uyarılan bir uyarıcı kavşak potansiyelini gösteren temsili bir sonuç yer almaktadır. Burada gösterilen uyarıcı kavşak potansiyeli genliği, her ikisinin de aktive olduğu bilinen iki motor nöronun toplam genliğidir.

M altı. Işığın daha düşük yoğunlukları veya daha kısa süreleri, tek bir motor nörondan kaynaklanan daha düşük amplitüdlü eksitatör bağlantı potansiyelini ortaya çıkarabilir. Az önce size, kurbağa nöromusküler bağlantısındaki sinaptik potansiyellerin kanal rodopsin 2 aracılı stimülasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik.

Bu prosedür uygulanırken, diseksiyon sırasında preparatın vücut duvarına zarar vermemeye dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, bir preparatın diseksiyonun hemen ardından aşırı uyarılmış olabileceği, ancak zamanla sakinleşerek sağlıklı kayıtlar alınmasına izin vereceği unutulmamalıdır. Kaslara impalasyon yaparken, birinci kas tabakasının altına, vücut duvarına inmemeye dikkat edin.

Elektrodunuz vücut duvarına saplandığında, bazen hiperpolarize potansiyeller elde edebilirsiniz ancak aslında bir kas hücresinin içinde olmayabilirsiniz. Durum bundan ibarettir.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.