Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Teer analizinin gerçekten benzersiz olan yanı, antijen spesifik T hücrelerini doğrudan görselleştirmenize olanak tanımasıdır. Teer, analizimizin temel benzersiz özelliğidir. Bu durum, gerçekleştirdiğimiz bir amplifikasyon adımıyla birleştirilmiştir.

Biliyorsunuz, T hücrelerini izole ediyoruz ve ardından onları, örneği ilgilendiğimiz T hücreleri açısından zenginleştiren bir ortamda büyütüyoruz. Böylece, sadece bu hücreleri spesifik olarak işaretleyebiliyor ve onları bir akış sitometresinde görselleştirebiliyoruz. Dolayısıyla, onlarca yıldır kullanılan CFSE veya proliferasyon analizleri gibi önceki yöntemlerle elde ettiğiniz şey, tüm T hücresi popülasyonunda neler olup bittiğine dair genel bir toplu ölçümdür.

Ancak vücutta milyonlarca T hücresi bulunur ve bunlar oldukça çeşitli bir desen kümesi görürler. Şanslıysanız, örnekteki hücrelerin belki her 200.000 ila 300.000'de bir tanesi aradığınız hücre olacaktır. Bu analizde zenginleştirme adımlarının uygulanmasının nedeni de budur.

Ardından bir test numarasıyla ve doğrudan boyama yaptığınız için, toplam hücre sayısının %1'inden daha az olan bir popülasyonu arka plandan ayrılarak görselleştirebilirsiniz. Böylece çok çok küçük farkları görebilir ve söz konusu kan örneğinde, yani ilgilendiğiniz paterni tanıyan o bireydeki T hücrelerinin sayısına ilişkin oldukça kesin bir sayım elde edebilirsiniz. Ancak süreç burada bitmiyor çünkü tetramerler sadece bu T hücrelerini etiketlemenize değil, aynı zamanda onları ileri analizler için izole etmenize de olanak tanır.

Ve kullandığınız tetterler aslında burada, BRI'da üretiliyor, doğru mu? Evet. Ülkede sınıf iki tetterleri başarıyla üreten çok az sayıdaki laboratuvardan biriyiz. Amacımız, bu teknolojiyi ithal etmekle ilgilenen tüm laboratuvarlara bu reaktifleri maliyet fiyatına dağıtmaktır.

Bu analiz yönteminin diğer laboratuvarlarda tekrarlanması söz konusu olduğunda, sizce en zor veya uğraştırıcı yönleri nelerdir? Şöyle bir düşündüğümde, aslında iki tane var; bunlardan biri T hücrelerinin büyütülmesidir. Bu süreç gerçekten biraz ustalık gerektiren bir iştir.

Hücrelerin ek besinlere mi yoksa büyümek için ek alana mı ihtiyaç duyduğuna dair neredeyse her gün karar vermeniz gerekir. Ardından, deneyimsiz bir operatör için muhtemelen en zor olan ikinci kısım ise veri analizidir. Sinyalin hangi kısmının gerçekten pozitif bir yanıt olduğunu, hangi kısmının ise sadece fiziksel özelliklerden ve çekimden kaynaklandığını belirlemek gibi.

Her şeyin bir dereceye kadar yapışkanlık özelliği göstermesi, özellikle genel yanıtın biraz zayıf olacağı durumlarda, yine oldukça fazla deneyim gerektiren bir konudur. Bu analizle elde edeceğiniz bilgilerin şu aşamada hastalara fayda sağlama potansiyeli nedir? Herhangi bir otoimmün hastada ortaya çıkan ilk belirgin özelliklerden biri, söz konusu hastalığa özgü bir dizi antikordur.

İmmünolojinin temel prensiplerinden, antikor yanıtının olduğu her yerde her zaman önce bir T hücresi yanıtının oluştuğunu biliyoruz. Bu nedenle, risk altındaki bireylerde antikor oluşumundan önce meydana gelen T hücresi aktivitesindeki bu artışı gözlemleyebilseydik, bu durum bireylerin otoantikor geliştirme yolunda olduğu yeni bir risk seviyesini tanımlamamıza yardımcı olur ve böylece muhtemelen müdahale edici tedaviler için bir fırsat penceresi açardı. Bu prosedür, antijene özgü CD4 pozitif T hücrelerini saflaştırıp genişletecek ve bunları tetras reaktifleri ve ekipmanları ile sınıf 2 laminer akışlı biyogüvenlik kabinleri kullanarak görselleştirecektir.

Burası prosedür için ana çalışma alanı olacaktır. PBMC izolasyonu için 50 mililitrelik konik tüpler ana tüplerdir; bir XPBS. Bu, kalsiyum ve magnezyum içermeyen, ışıktan korumak için folyoya sarılmış fol pak artı olmalıdır; pipet yardımcısı, kanın santrifüjü kontamine etmesini önlemek için 50 mil insertli CoStar 10 mil pipet aerosol kanisterleri.

GS altı R santrifüj transfer pipetleri, litre başına 8,3 gram amonyum klorür, 1,0 gram sodyum bikarbonat ve 0,04 gram sodyum EDTA içeren hemolitik tampon, DI su, PBS içerisinde %0,2'lik tripan mavisi çözeltisi, hemo SİTOMETRE, 15 mililitrelik konik tüp, iki milimolar EDTA ve litre başına beş gram eklenmiş PBS içeren çalışma tamponu.

Milin Biotech'ten satın alınan BSA max CD four izolasyon kiti iki, Stem Cell Technologies'den satın alınan EP manyetik blok. Diğer manyetik hücre zenginleştirme platformları da benzer etkinlikte kullanılabilir. Beş mililitrelik polipropilen tüp, T-hücresi medyumu hazırlamak için kullanılan 25 milimolar HEPES ile desteklenmiş RPMI 1640, T-hücresi medyumunu desteklemek için kullanılan havuzlanmış insan serumu, T-hücresi medyumunu desteklemek için kullanılan pen strip, 500 mililitrelik 0,22 mikron şişe üstü filtre, in vitro ekspansiyon kültürü için kullanılan steril 48 kuyucuklu plaka, adım 37 derece CO2 inkübatörü, ilgilenilen epitopu içeren sentetik peptidin 20 miligram/mililitrelik çözeltisi.

Antijen spesifik T hücrelerini görselleştirmek için beş mililitrelik polistiren faks tüpü peptid yüklü sınıf iki teer kullanıldı; antijen spesifik T hücrelerinin kaplanması için anti CD three, anti CD four ve anti CD 25 antikorları kullanıldı. Prosedüre başlamadan önce faks kalibre akış sitometresi veya eşdeğeri hazır bulundurun. Tüm malzeme ve ekipmanları çalışma alanınızda bir araya getirin.

Aşağıdaki gösterim şu adımları kapsayacaktır: PBMC izolasyonu, CD4 pozitif T hücresi ayrıştırması, in vitro ekspansiyon kültürü ve T hücrelerinin TEM veya boyama ile görüntülenmesi. Birinci adım: PBMC izolasyonu.

Bir kan örneği temin edin. Pıhtılaşmayı önlemek için kan, şırıngalara veya kan tüplerine toplanmalı ve 1:50 oranında heparin ile antikoagüle edilmelidir; mililitre başına yaklaşık 1 milyon PBMC verimi beklenir. Bunların yaklaşık %40'ı CD4 pozitif T hücreleri olacaktır.

Kanı 50 mililitrelik konik tüplere paylaştırın. Her tüpe 25 mililitre kan ekleyin. Plazmayı dağıtmak için ALI pıhtılaşması öncesinde kanı nazikçe karıştırın.

Toplam hacim 40 mililitre olacak şekilde PBS ekleyin ve kan tüpüne yerleştirilen flakondaki 11 mililitrenin kurutulmasıyla alt tabakayı oluşturun; bu sırada pipet yardımcısını pipetten dikkatlice çıkarın. Flakon yavaşça tüpün dibine süzülecektir. Seviye eşitlendiğinde, pipeti kan tüpünden yavaşça çıkarın, kan tüplerinin kapaklarını kapatıp atın ve aerosol kanisterlerine aktarın.

Kanisterleri sıkıca kapatın ve frenleme olmadan 20 dakika boyunca 900 ×g'de santrifüjleyin. Bu döndürme işleminin sonunda frenleme uygulanmaması kritik öneme sahiptir, çünkü frenleme kuvveti döndürme sonrası hücre tabakasını bozacaktır. PBMC'ler, üstteki sarı plazma ile alttaki şeffaf faz arasında belirgin beyaz bir tabaka oluşturmalıdır.

Bir transfer pipeti kullanarak beyaz kan hücresi tabakasını nazikçe üzerinden alın ve yeni bir tüpe aktarın. PBMC'lerle birlikte bir miktar plazma ve fial çekilebilir, ancak kırmızı hücre tabakasından herhangi bir kısmın çekilmemesine dikkat edin. Genellikle bu aşamada iki kan tüpü tek bir hücre tüpünde birleştirilebilir.

Pelet boyutunu artırmak için, toplam hacmi 15 milliliters seviyesine getirecek şekilde PBS ekleyin ve düşük frenleme ile aerosol korumalı santrifüj kanisterlerinde 500 times G hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin; sıvıyı, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek bir pastör pipeti yardımıyla aspire edin. Her tüpe beş ila altı milliliters hemolitik tampon ekleyerek ve topaklanmaları gidermek için nazikçe karıştırarak işlem yapın. Beş dakikadan fazla inkübe etmeyin.

Toplam hacim 50 mililitre olacak şekilde PBS ekleyin ve 230 ×g kuvvetinde 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu daha yavaş döndürme işlemleri için düşük frenleme modunda aerosol kanisterlerine artık gerek yoktur. İki kez yıkama yapın; tüpü PBS ile doldurulmuş bir pastör pipeti kullanarak sıvıyı aspire edin ve son yıkama adımından önce 230 ×g kuvvetinde 10 dakika santrifüjleyin; resüspande edilmiş hücrelerden bir alikot alın, tripan mavisi ile seyreltin ve bir hemositometre kullanarak sayın.

Bu hücre sayımı, T-hücre ayırmasında kullanılan reaktif hacimlerini belirleyecektir. İkinci adım olan CD4 pozitif T-hücre ayırmasında, sıvıyı aspire edin ve toplam hacmi 10 milyon hücre başına 40 µL'ye çıkarmak için çalışma tamponu ekleyin. Bu işlem genellikle 30 µL tampon ve kalıntı pelet hacmi gerektirir.

Bu hacmi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. CD four izolasyon kitlerinden gelen antikor kokteylini, her 10 milyon hücre için 10 µL olacak şekilde ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Tüpü buzdan çıkarın, kapağını açın ve her 10 milyon hücre için 30 µL çalışma tamponu ekleyin.

CD4 izolasyon kitinden manyetik boncuklar ekleyin. 10 milyon hücre başına 20 µL ekleyip tüpün kapağını kapatın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Yıkama işlemi için 10 hacim çalışma tamponu (running buffer) ekleyin ve 10 dakika boyunca 230 ×g'de santrifüjleyin.

Santrifüj sırasında, mıknatısı ve beş mililitrelik polipropilen tüpü çalışma alanınıza yerleştirin. Hücre peletinden sıvıyı aspire edin. İki mililitre çalışma tamponu ekleyin ve transfer pipeti kullanarak topaklanmaları giderin.

Aynı transfer pipetini kullanarak hücreleri beş mililitrelik tüpe aktarın ve mıknatıs içerisinde 15 dakika inkübe edin. Mıknatısı ters çevirip son damla hariç tüm sıvıyı boşaltarak, CD4 pozitif T-hücresi fraksiyonunu işaretlenmiş 15 ml'lik bir tüpe dikkatlice dekante edin. Beş mililitrelik tüpe iki mililitre daha çalışma tamponu ekleyin ve tüpü mıknatıstan çıkarın.

CD4 negatif hücreleri tüpün kenarlarından nazikçe durulayın ve işaretli bir 15 ml'lik tüpe aktarın. Her tüpe iki mililitre T-hücresi ortamı ekleyin. Hücre sayımı için alikotlar alın ve 10 dakika boyunca 230 ×g'de santrifüjleyin.

Hücre alikotlarını tripan mavisi ile seyreltin ve bir hemositometre kullanarak sayın. Bu hücre sayımları, ekspansiyon kültürü için kullanılacak kuyucuk sayısını belirleyecektir. Üçüncü adım.

In vitro genişletme kültüründe, hücre sayılarına göre CD4 pozitif ve CD4 negatif hücre peletlerinden sıvıyı aspire edin. CD4 pozitif hücrelerin hacmini ml başına 3 milyon hücre olacak şekilde ayarlamak için medya ekleyin. CD4 negatif hücrelerin hacmini ml başına 10 milyon hücre olacak şekilde ayarlamak için medya ekleyin.

Ekspansiyon kültürü, kuyuk başına 3 milyon CD4 negatif hücre ve 2 ila 3 milyon CD4 pozitif hücre gerektirir. Genellikle, CD4 pozitif hücreler sınırlayıcı popülasyondur. CD4 negatif hücreleri, 48 kuyucuklu bir plaka üzerindeki uygun sayıda kuyucuğa paylaştırın.

Her birine 300 µL ekleyerek plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre bir saatliğine yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın, kuyucuklara 500 µL taze besiyeri ekleyip bir transfer pipeti kullanarak nazikçe 12 ila 20 kez yukarı-aşağı pipetleme yaparak ve tüm sıvıyı uzaklaştırarak kuyucukları yıkayın. Bu yıkama işlemi, geride yapışkan antijen sunan hücrelerden oluşan bir tabaka bırakacaktır.

Yıkama işlemi tamamlandığında, her kuyucuğun tabanını ıslatacak kadar, yaklaşık 100 µL besiyeri ekleyin. Aksi takdirde aderen hücreler kuruyacaktır. Gerekiyorsa, her kuyucuğa 2 ila 3 milyon CD4 pozitif hücre ekleyin.

Her bir kuyucuktaki toplam hacmi bir mililitreye tamamlamak için ek besiyeri ekleyin. Her kuyucuğa istenen peptidi ekleyin. Stimülasyon için tipik konsantrasyon mililitre başına 10 mikrogramdır.

Son olarak plakayı yedi gün boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Yedi gün sonra, takip eden her gün her kuyucuğa 50 µL hemo IL 2 ekleyin.

Mikroskop altında hücre büyümesini izleyin; henüz konfluent olmamış kuyucuklarda besiyerinin yarısını uzaklaştırıp taze besiyeri ve 50 µL IL-2 ekleyin; konfluent olan kuyucukları ise hücreleri süspanse edip hücrelerin yarısını boş bir kuyucuğa aktararak bölün. Taze besiyeri ve 50 µL IL-2 ekleyerek hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Genişleyen hücreler, 13 ila 15 günlük kültürden sonra TEER boyaması için hazır olacaktır.

Dördüncü adım, T hücrelerinin tetramer boyama ile görselleştirilmesi; peptit ile uyumlu tetramerler satın alın veya hazırlayın. CD4 pozitif T hücrelerini stimüle etmek için kullanılan MHC kombinasyonları. Plakayı inkübatörden çıkarın.

Her bir kuyucuktaki besiyerinin yarısını dikkatlice çekin. Her kuyucuktan genellikle 75 µL veya yaklaşık 50.000 hücre içeren bir hücre alikotunu beş mL'lik bir polistiren Fax tüpüne aktarın; genellikle toplam hacmin her 50 µL'si için 1 µL olacak şekilde teer ekleyin ve bir saat boyunca 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Negatif kontrol olarak, her kuyucuğun ikinci bir alikotunu uyumsuz bir teer ile boyamanız da önerilir; hücreleri anti-CD3, anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları ile etiketleyin.

Ek veya alternatif antikor markörleri kullanılabilir. Ancak, bu kanal şu an için teems için ayrılmış olduğundan PE işaretli antikorlar kullanmayın. Ayrıca, herhangi bir tek renkli veya izotip kontrolünü ekstra hücreler kullanarak işaretleyin.

Antikorla işaretlenmiş hücreleri dört derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin. Her tüpü 0.5 ila 1 mL akış tamponu ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 230 ×g'de santrifüjleyin. Sıvıyı tüplerden dikkatlice dökün; akış sitometresini referans boncuklar, tek renk kontrol tüpleri, izotip kontrolleri ve benzerlerini kullanarak kalibre edin.

Her bir tüpü akış sitometresi kullanarak analiz edin. Tetra pozitif hücreler, genişletilmiş CD 4 pozitif T hücreleri arasında belirgin bir popülasyon oluşturmalıdır. Tetra pozitif hücreler genellikle CD 25 pozitiftir ve sıklıkla CD 4 yüksek düzeydedir.I.