Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ

ISTH olarak bilinen bir teknikle, in situ hibridizasyon ve tetramer boyama birleştirilerek, viral antijen spesifik immün efektör hücreler ile viral olarak enfekte olmuş hücreler ve dokular arasındaki bağıl sayılar ve mekansal ilişkiler belirlenebilir. ISTH, taze SIV enfekte dokunun agros içine gömülmesiyle başlar. Doku, bir vibratom kullanılarak 200 micron kalınlığında kesitler halinde kesilir ve viral antijen için boyanır.

FitC işaretli MHC tetramerleri kullanılarak spesifik CD8 pozitif hücrelerin belirlenmesi. Dondurma işleminden sonra, bu boyanmış kesitler bir kriyostat kullanılarak 8 µm kalınlığında kesitlere ayrılır ve viral olarak enfekte hücreleri lokalize etmek için in situ hibridizasyon uygulanır. Çift boyamalı kesitlerin görüntülenmesi ve nihayetinde immün efektör ile hedef hücreler arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için orijinal kalın kesitlerin yeniden oluşturulması amacıyla konfokal mikroskopi kullanılır.

Erken evre SIV enfeksiyonunu incelemek için bu prosedürün kullanılması, sonrasında gelişen hastalığın şiddeti için iyi bir öngörücü olduğunu kanıtlamıştır. Merhaba, ben Minnesota Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümü'nde Ashley HA'nın laboratuvar ekibinden Chinen Lee. Ben de Minnesota Üniversitesi Veteriner Biyomedikal Bilimler Bölümü'nde yardımcı doçent olan Pam Skinner.

Bugün size, kısaca ISTH olarak adlandırılan in situ tetramer boyama ve hibridizasyon prosedürünü göstereceğiz. Bugün uygulamalı olarak göstereceğimiz in situ tetramer boyama ile in situ hibridizasyon kombinasyonunun yanı sıra, antijenle spesifik CD8 T hücrelerinin in situ konumunu, bolluğunu ve protein ekspresyon profilini belirlemek için rutin olarak in situ tetramer boyama ile immünohistokimyayı birlikte kullanıyoruz. Bugün kalın kesitlerle gerçekleştirilecek in situ tetramer boyama aşamasında bize Dr. Heon Kim ve Terry Matala yardımcı olacak; ince kesit hazırlama ve in situ hibridizasyon aşamasında ise So bize destek verecek. Hadi başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, steril PBSH içeren Vibram banyosunu 2 °C'ye kadar soğutun. Vibratör bıçak açısını 27 dereceye ayarlayın. Mümkün olduğunca taze dokuları buz üzerinde soğutun ve prosedüre dokular toplandıktan sonraki 24 saat içinde başlayın.

Degradasyonu minimize etmek için, vibrotom aynı zamanda taze dokunun kesilmesini, bağ dokusunun temizlenmesini ve numunenin bistüri ile küçük parçalara ayrılarak bir whey boat içerisine yerleştirilmesini ve yaklaşık 40 °C'de eritilmiş PBS içindeki %4 düşük erime noktalı agar ile kaplanmasını kolaylaştırır. Dokunun kabın tabanıyla temas ettiğinden emin olun ve eğer parçalar yüzüyorsa onları aşağıya doğru itin, ardından üç ila beş dakika boyunca buz üzerinde dondurun.

Burada dalak dokusu kullanılmaktadır, ancak bistüri ile lenf düğümü, vajina, serviks, uterus veya diğer taze dokular da kullanılabilir. Dokunun etrafındaki agros'u kesin ve pens yardımıyla agros gömülü dokuyu doku bloğuna dikkatlice aktarın. Bir Vibram doku bloğunu Loctite yapıştırıcı ile kaplayarak işleme devam edin.

Doku parçası doku bloğu üzerine yerleştirildikten sonra hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Ardından, doku bloğunu vibratöre yerleştirin ve çok düşük bir ileri hız ile nispeten yüksek bir amplitüd kullanarak dokuyu 200 mikrometre kalınlığında kesitler halinde kesin.

Kesilmiş bölümleri, bir 24 kuyucuklu doku kültürü plağının kuyucuğuna yerleştirilmiş ve içi bir mililitre soğutulmuş PBSH ile önceden doldurulmuş özel bir doku haznesine aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Her doku haznesine dört adede kadar doku bölümü yerleştirin. Viral spesifik T hücreleri için doku bölümlerini boyamak amacıyla örnekleri etiketleyin ve plağın kapağını bir paket lastiği ile sabitleyin.

ZI konjuge tetramerler önce bloklama tamponu ile ml başına 0,5 µg olacak şekilde seyreltilir. Çözelti, her kuyucuğa 1 ml olacak şekilde 24 kuyucuklu bir plakaya pipetle aktarılır. Taze kesilmiş doku, plaktaki doku bölmelerine aktarılır ve 4 °C'de gece boyunca sallanmaya bırakılır.

Sonraki adımlarda solüsyonların çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı örnekler içeren doku odacıkları arasında boş bir kuyucuk bırakın. Bu adımda, hücre dışı veya hücre yüzeyi proteinlerine yönelik antikorlar eklenebilir. Yıkama işlemi için, birincil inkübasyondan sonra soğutulmuş PBSH içeren 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakası hazırlayın.

Doku odacıklarını, her seferinde 20 dakika boyunca önceden doldurulmuş bir plakaya aktararak iki kez yıkayın; aktarmadan önce doku odacıklarındaki sıvının çoğunun boşaldığından emin olun. Ayrıca, doku odacıklarını taşırken bir örneğin içeriğinin diğerine damlamamasına dikkat edin ve kesitlerin doku odacıklarının kenarlarına yapışmadığından emin olmak için onları izleyin. Fiksasyondan sonra, kesitleri oda sıcaklığında iki saat boyunca PBS içinde taze %4 paraformaldehit ile sabitleyin.

Tetramerlerden gelen sinyali artırmak için soğuk PBSH ile her biri beş dakika sürecek şekilde iki kez yıkandı. Kesipleri, bloklama tamponu içinde 1:10.000 oranındaki tavşan anti-fitzy antikorları ile bir ila üç gün boyunca inkübe edin. Bu aşamada, hücre içi epitoplara karşı antikorlar eklenebilir.

Antikor eklemeden önce hücrelerin permeabilize edildiğinden ve spesifik olmayan bölgelerin bloke edildiğinden emin olun. Sinyali güçlendirmeyi amaçlayan ikinci uzun inkübasyondan sonra antijen geri kazanımı da gerekebilir. Kesitleri PBSH ile her seferinde en az 20 dakika ve birkaç saate kadar olmak üzere üç kez yıkayın.

Uygun floresan işaretli antikorlarla son bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, tetramer boyamalı hücrelerin kırmızı floresan vermesini sağlamak için tavşan anti-fitzy antikorlarını bağlamak amacıyla goat anti-rabbit SI three kullanılabilir. Katil T hücrelerini görselleştirmek için CD eight gibi ilgi duyulan proteinleri karşıt boyamak amacıyla fare antikorları kullanılmışsa, fare antikorlarına bağlanmak ve antikor boyamalı hücrelerin yeşil floresan vermesini sağlamak için goat anti-US Alexa 488 kullanılabilir; her bir antikorun dilüsyonları ampirik olarak belirlenmelidir.

Plakları ve alüminyum folyoyu sararak kesitleri ışıktan koruyun ve bir ila üç gün boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında ve sonrasında ışık floresan sinyallerini söndürür. Son olarak, tetramerleri ve antikorları sabitlemek için kesitleri tekrar fikse edin. Yıkayın ve in-situ hibridizasyon için ince kesitler hazırlayana kadar -20 °C'de saklamak üzere, mililitrede dört miligram N profil gallat içeren gliserol jelatin ile mikroskop lamına monte edin.

İn situ tetramer boyamalı kesitler, antijen spesifik CD8+ T hücrelerinin lokalizasyonu, bolluğu ve protein ekspresyon paterni belirlenmek amacıyla konfokal mikroskop ile analiz edilebilir; gösterilen görüntüde, SIV enfekte bir rhesus macaque'den alınan dalak doku kesitleri, SIV spesifik CD8+ T hücrelerini işaretlemek için gag tetramerleri ile, ayrıca CD20 antikorları ve CD3 antikorları ile boyanmıştır. Antikorlarla yapılan karşıt boyamalar bir sonraki adımda kaybolacağı için, işlemlere devam etmeden önce in situ tetramerlerin analiz edilmesi önemlidir.

Kalın kesitleri lamdan ayırmak için, 200 mikron kalınlığındaki kesitleri bir ısıtma bloğunda 70 °C'de beş dakika ısıtarak ince kesit alma işlemine başlayın. Kesitler ayrıldıktan sonra, önce plastik kalıbın altını OCT ile doldurarak, kesitleri kuru buz üzerinde OCT'ye gömün. Ardından dokuyu OCT'nin üzerine yerleştirin ve üzerini tekrar OCT ile kapatın.

OCT gömülü kesitlerden sekiz mikron kalınlığında kesitler almak için bir kriyostat kullanın ve sekiz mikronluk kesitleri silanize lamlara yapıştırın. Lamlar daha sonra sonraki in situ hibridizasyon işlemi için sızdırmaz bir kutuda eksi 80 derece Celsius'ta saklanabilir. Virüsle enfekte olmuş hücreleri S 35 işaretli virüse özgü rib problar aracılığıyla tespit etmek için standart in situ hibridizasyon kullanılır.

Prosedür ayrıca kesitlerin nükleer iz emülsiyonu ile kaplanmasını ve lamların hazırlanmasını içerir. Floresan uyumlu paramount ortamında konfokal görüntüler, epi tüp mavi yansıma cihazı ile donatılmış bir BioRad MRC 1000 konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. In situ tetra boyaması, kırmızı tetra florokromu için EPI one 605 ve in situ hibridizasyon için yeşil CD8 florokromu için EPI 2 522 DF 32 kullanılarak görselleştirilir.

Geliştirilmiş radyografideki in-situ hibridizasyon sinyalinden kaynaklanan gümüş tanecikleri için EPI iki mavi yansımayı kullanın. Görüntüleme işlemine başlamak için, her kesitin görüntülerini soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru alın ve her görüntünün komşu görüntülerle yaklaşık %20 örtüştüğünden emin olun. Yeniden oluşturulan montaj görüntüsünde boşluklar oluşmasını önlemek için, her görüntüyü bir Excel dosyasındaki satır ve sütununa göre adlandırın.

Slaytlardan veri toplama işlemi tamamlandığında, yazarlardan temin edilebilen bir Photoshop seven işlem prosedürünü kullanarak, her kanal için Z seri görüntülerini tek bir görüntüye izdüşürmek amacıyla konfokal asistan yazılımını kullanın; üç kanaldan gelen izdüşürülmüş görüntüyü otomatik olarak tek bir RGB görüntüsünde birleştirin. Ardından, tüm kesitin bir montaj görüntüsünü oluşturmak için birleştirilmiş görüntüleri katmanlar halinde birbirine ekleyin. Montaj üzerindeki bireysel gümüş tanelerini ve tetramer boyamasını, metamorph veya Photoshop kullanarak hücrelerle ilişkilendirin.

Viral RNA pozitif ve tetramer pozitif hücrelerin merkezlerinin XY koordinatlarını veya OID'lerini atayın. OID verilerini her hücre için sayısal değerler olarak Excel dosyalarına aktarın ve tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin toplam sayıları üzerinden, kesitteki immün efektör (e) hücrelerin viral hedef (T) hücrelere oranını belirlemek ve tetramer pozitif ile RNA pozitif hücreler arasındaki uzamsal ilişkileri saptamak için Excel dosyalarında toplanan verileri kullanın. Bunların ilgili grafiklerini Excel dosyalarından kopyalayıp Photoshop'taki bir Photoshop belgesine yapıştırın.

Izgaraların renk ve seçim açısından örtüşmesi için bir katmanın opaklığını azaltarak hizalama ve ölçeklendirme yapın, ardından seçip yeni bir katmana kopyalayıp yapıştırın. Mavi RNA pozitif hücrelerin konumları belirlendikten sonra, ızgaraları hizalamak için kullanılan katmanı kaldırın; böylece düzleştirilmiş görüntüde tetramer pozitif ve viral RNA pozitif hücrelerin konumları ortaya çıkacaktır. Burada gösterilen ISTH yöntemi ile, intravajinal inokülasyon sonrası giriş kapısındaki ve enfeksiyonun yayıldığı lenfatik dokulardaki SIV enfeksiyonuna karşı verilen bağışıklık yanıtını takip edebiliyoruz.

Enfeksiyondan 10 gün sonra bu doku bölgelerinde çok sayıda enfekte hücre bulunmaktadır; ancak üç gün sonrasında bile, yeşil boyalı CD A pozitif hücreler mevcutken, henüz kırmızı boyalı SIV spesifik tetra pozitif hücreler görülmemektedir. Bu nedenle, bağışıklık yanıtı enfeksiyonu temizlemek için çok geç kalmıştır.

Bununla birlikte, enfeksiyondan üç hafta sonra, özellikle giriş portalında enfekte hücrelerdeki azalma açıkça görülmektedir. Azalmanın boyutunun, tetramer pozitif immün efektör hücrelerin mekansal yakınlığı ve göreceli sayıları ile ilişkili olduğunu göstermek için ISTH kullandık. N-S-I-V-R-N-A pozitif hedef hücreler; buna in vivo E/T oranı diyoruz.

Mekansal ilişkiler, bu enfekte lenf düğümünde efektör hücrelerin kırmızı, viral hedeflerin ise mavi ile renklendirildiği bu yöntem kullanılarak kolayca görselleştirilmektedir. Birçok efektör ve hedef hücre birbirine yakın konumdadır ve bazı bölgelerde birçok efektör hücre tek bir S-I-V-R-N-A pozitif hücreyi çevrelerken, diğer bölgelerde S-I-V-R-N-A pozitif bir hücre tek başına bulunmaktadır. ETT oranı, hücrelerin konumları belirlenip Excel dosyasına her birinden kaç adet olduğu kaydedildikten sonra basitçe hesaplanmaktadır.

Viral enfeksiyonun en iyi kontrolü, kırmızı efektörlerin yeşil hedeflere oranının 43'e bir gibi büyük bir fazlalıkla korelasyon göstermesiyle ilişkilidir. Bu durumda, enfeksiyonun başladığı serviks ve vajinada ETT oranları lenf düğümlerinde daha düşüktü. Yüksek ETT oranları ile viral yükün zirve noktadan itibaren azalması arasındaki pozitif korelasyon, giriş kapısındaki daha güçlü bir bağışıklık yanıtının enfeksiyonun daha iyi kontrol edilmesi anlamına geldiğini göstermektedir.

Çok spesifik CDAT hücrelerini ve virüs enfekte hücresini in situ olarak eş zamanlı olarak nasıl tespit edeceğinizi göstermiş olduk. Bu teknik, dokulardaki antijen spesifik T hücrelerini ve virüsle enfekte hücreleri aynı anda görselleştirmemize olanak tanır. Bu teknik, CD 8 pozitif T hücresi tabanlı aşıların yanı sıra diğer non-viral patojen ve konak etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir.

Hibridizasyon işlemlerinden önce tüm reaktiflerin RNaz'lardan arındırılmış olduğundan emin olmak önemlidir. İşte hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.