S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Bu prosedür, yem suşun SLAC kontrol suşu için normal amino asitler içeren besiyerinde, diğer suşun ise ağır izotopik lizin ve arjinin içeren besiyerinde kültüre edilmesiyle başlar. Her iki suştan eşit miktarlar karıştırılır ve öğütme ve sıvı azot yoluyla lizize edilir. Ham lizatlar, önce santrifüjle pelletlenir ve ardından spheros boncuklarına bağlanarak temizlenir. Hücre lizatı daha sonra IgG boncuklarına bağlanır.

IgG boncuklarına bağlı proteinler proteaz ile açığa çıkarılır, parçalanır ve çöktürülür. Örnek artık kütle spektrometrisi ile analiz için hazırdır. Merhaba, ben University of British Columbia Yaşam Bilimleri Enstitüsü Hücre Çevresel Biyolojisi Bölümü'ndeki Lone Laboratuvarı'ndan Jesse Chao.

Bugün size, afinite saflaştırma ile birleştirilmiş, SILAC olarak adlandırılan kantitatif proteomik analiz prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda protein komplekslerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedürde, yem suşu normal amino asitler içerirken, SLAC kontrol suşu ağır izotopik lizin ve arjinin içerir. Başlamak için, öncelikle yem suşu ve kontrol suşunun her birini ayrı ayrı ekranınızda gösterilen değere ulaşana kadar birer litre yetiştirin. Ardından, kültürü 500 mililitrelik Nalgene santrifüj tüplerine boşaltın.

Pellet hücrelerini 2.580 RCF'de dengeleyin, medyumu dökün ve pelletini 50 mililitre soğuk D H2O ile yeniden süspande edin. Hücreleri 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarırken, hücreleri pelletlemek için tüpleri 3.000 RCF'de santrifüjleyin. Bu aşamada, pelletini -80 °C'de dondurabilirsiniz.

Kontrol suşu kültürünün, kuru pelet ağırlığına göre yem suşu kültürüyle bire bir oranında eşleştirildiğinin hatırlanması önemlidir. Her bir hücre peletini, 1/2000 oranında proteaz inhibitör kokteyli içeren 10 mililitre NP 40 tamponu içinde yeniden süspande edin. İki hücre kültürünü, bir tüpü doğrudan diğerine boşaltarak karıştırın.

Hücreleri öğütmeye başlamak için öncelikle önceden soğutulmuş havana sıvı azot dökün ve tamamen buharlaşmasını bekleyin. Ardından, havana iki mililitre hücre ekleyin. Hücreleri dondurmak için bir miktar sıvı azot dökün.

Hücreler ince bir toz haline gelene kadar öğütün. Tüm hücreler öğütülene kadar işlemi tekrarlayın. Hücrelerin çözülmediğinden emin olun.

Gerektiğinde sıvı azot ekleyin. Ardından, tozu buz soğukluğundaki bir behere aktarın ve oda sıcaklığında çözülmeye bırakın. Kenarlar çözülmeye başladığında, çözülme işlemi tamamlandıktan sonra 1/200 oranında PIC içeren 20 mililitre NP 40 tamponu ekleyin.

Kaba lizatı 40 mililitrelik Nalgene tüplerine aktarın ve bir Sovos SA 600 rotorunda 16,000 RPM'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Beklerken, SROs iki B boncuklarından 300 mikrolitre alın ve boncukları 300 mikrolitre NP 40 tamponunda üç kez yıkayın. Ardından, boncukları bir bire bir bulamaç olacak şekilde 300 mikrolitre tampon içinde yeniden süspande edin.

Bir sonraki adım, hücre lizatının ön temizliğidir. Bunun için öncelikle süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve Spheros iki B boncuklarını ekleyin. Soğuk odadaki bir döner platformda 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, 300 mikrolitre IgG SROs altı boncuğu alın ve boncukları 300 mikrolitre NP 40 tamponunda üç kez yıkayın. Ardından, boncukları bir bire bir bulamaç oluşturacak şekilde 300 mikrolitre tampon içinde yeniden süspanse edin. İnkübasyon sonrası SRO'ları peletleyin.

İki adet boncuk ekleyin. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra western blotting analizi için hücre lizatından bir alikot ayırmayı unutmayın.

Ardından IgG boncuklarını ekleyin. Daha verimli bir bağlanma için içeriği iki tüpe ayırın ve soğuk odada, döner bir platform üzerinde iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası boncukları dört derece santigrat sıcaklıkta bir kromatografi kolonunda toplayın.

Bağlanmamış fraksiyondan bir alikot sakladığınızdan emin olun. Boncukları 10 mililitre NP 40 tamponu ile yıkayın.

Ardından, boncukları üç mililitre TEVC tamponu ile yıkayın. Tekrar hatırlatmak gerekirse, boncukların bir alikotunu saklamayı unutmayın.

Bu, boncukları elüye etmek için bağlanma verimliliğini yansıtacaktır. İlk olarak, bir mililitre TEVC tamponuna beş mikrolitre A-C-T-E-V ekleyin. Boncuklara TEVC tamponu ekleyin ve karıştırın.

Daha etkili bir karıştırma için içeriği iki adet 1,5 mililitre EINOR tüpüne aktarın ve soğuk odada, dönen bir platform üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ardından, boncukları çöktürmek için santrifüjleyin ve elüatı taze bir 1,5 mililitre tüpüne aktarın. Yıkamanın ardından boncukları ek 0,5 mililitre TEVC tamponu ile yıkayın.

Sekiz örneği tek bir tüpte birleştirin. Toplamda 1.5 mililitre ELU sekiz örneğine sahip olmanız gerekir. Çöktürme işlemi için TEV Elu sekiz örneğinden bir alikot ayırın.

Aliquotları, yüzde yüz TCA ile %25TCA düzeyine ayarlayın. Bunun için, 1,5 mililitre LU sekiz'i her biri 750 mikrolitre olacak şekilde iki tüpe ayırın. Tüpe 250 mikrolitre %100TCA ekleyin.

Çözeltiniz sütlü bir görünüm almalıdır. Ardından, çözeltiyi 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. İnkübasyon sonrası karışımı periyodik olarak vorteksleyin.

Soğuk odadaki masaüstü santrifüjde maksimum hızda 30 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.05 normal hidroklorik asit içeren 500 µL buz soğuk aseton ile bir kez yıkayın. Ardından 4 °C'de maksimum hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, bir kez 500 µL buz soğukluğunda aseton ile yıkayın ve dört derece santigrat sıcaklıkta maksimum hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj sonrası asetonu dikkatlice uzaklaştırın ve peleti gümüş boyama için kurutun. Peleti 50 µL 1x SDS örnek tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Çöktürülmüş proteini kütle spektrometrisi tabanlı analizler için kullanmayı planlıyorsanız, çöktürme işlemini etanol kullanarak yapmanız önerilir. Bunun için öncelikle 20 µg glikojen ekleyin, ardından örnekleri %100'lük etanol ile beş kat seyreltin ve pH 5,0'da 2,5 M stok çözelti kullanarak 50 mM sodyum bikarbonat ile ayarlayın. Tüpü tersyüz ederek çözeltiyi karıştırın.

Oda sıcaklığında iki saat boyunca bekletin. Son olarak, içeriği iki eppendorf tüpüne bölün. Çökmüş proteini, oda sıcaklığında 12.000 g'de 10 dakika santrifüj ederek pelletleyin.

Saflaştırma prosedürü sırasında saklanan alikotlar; ön temizleme yapılmış hücre lizatını, bağlanan fraksiyonu, bağlanmayan fraksiyonu ve elüe edilen fraksiyonu içermelidir. Deneyin bağlanma ve elüsyon verimliliğini yansıtmak için yukarıdaki alikotların protein içeriklerinin Anti-TAP antikor kullanılarak Western blotting veya gümüş boyama ile analiz edilmesini öneririz. Bu gümüş boyama jelinde, saflaştırılmış SCS two tap ve etkileşim ortakları görselleştirilmiş ve bu Western blot'ta etiketlenmemiş bir kontrolle karşılaştırılmıştır.

SCS two tap saflaştırması sırasında alınan çeşitli fraksiyonlar, Anti-tap antikoru kullanılarak Western blotting ile analiz edildi. TEV proteaz kesimi ile elüsyondan sonra SCS two tap'in daha düşük bir moleküler ağırlıkta göç ettiği ve elüsyon sonrası IgG boncuklarında hiç SCS two tap kalmadığı görülmüştür. Bu durum, saflaştırmanın oldukça verimli olduğunu doğrulamıştır.

IgG boncukları ile afinite saflaştırması kullanarak protein komplekslerinin nasıl saflaştırılacağını size gösterdik. Bu prosedürü uygularken, saflaştırma işlemine başlamadan önce baz suş ile kontrol suşunu kuru pelet ağırlığına göre eşleştirdiğinizden emin olmanız önemlidir. LAC bize protein bağlama partnerlerinin tarafsız ve nicel ölçümlerini sunduğundan, örnek kaybını minimize etmek için tap saflaştırmasının yalnızca ilk aşamasını gerçekleştiriyoruz.

Önemli miktarda spesifik olmayan bağlanma ile karşılaşırsanız, cold springing harbor kılavuzunda bulunan protokolün tamamını uygulamak isteyebilirsiniz. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

Hey, hadi, mark. Ah, git.