Protein Kompleksi belirlenmesi

Bu deneyin amacı, E. coli'den elde edilen doğal MultiPro komplekslerinin proteinlerini, protein etkileşimlerini ve alt birim kompozisyonunu belirlemektir. Bu işlem, SPA etiketi ile seçilebilir bir markörü kodlayan diziye özgü lineer PCR ürünlerinin amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir; bu ürünler, bakteri Fage lambda rekombinasyon sistemi kullanılarak ddy 3, 3 0 arka planında karboksil terminal füzyonları olarak çerçeve içi (in frame) şekilde entegre edilir ve eksprese edilir. İkinci bir adım olarak, düşük bolluktaki protein komplekslerini verimli bir şekilde geri kazanmak için sığır modlin ve Anti-Flag afinite boncukları kullanılarak iki aşamalı bir saflaştırma işlemi uygulanır. Ardından, sığır modlin, elüsyon tamponu veya CEB ile elüye edilen bağlı proteinler tripsin ile sindirilir ve protein tanımlaması için kütle spektrometrisi ile işlenir.

Elde edilen sonuçlar, transkripsiyon terminasyonu ve anti-determinasyon faktörleri dahil olmak üzere çekirdek RNA polimeraz enziminin çeşitli alt birimlerinin, etiketli RNA polimeraz alt birim D proteini ile verimli bir şekilde birlikte saflaştırıldığını göstermektedir; bu durum, yeni ilişkilendirilen bileşenlerin bu yaklaşım kullanılarak etkin bir şekilde ortaya çıkarılabileceğini belirtmektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, iki turlu afinite saflaştırma işlemlerinde zorluk yaşayabilirler; büyük ölçekli kültürlerden düşük ve yüksek bolluktaki yük komplekslerinin verimli bir şekilde geri kazanılmasında başarıyı sağlamak için hücre lizatlarının uygun tampon çözeltilerle dikkatli bir şekilde işlenmesi kesinlikle gereklidir. Afinite saflaştırma ve kütle spektrometrisi prosedürlerini laboratuvarımdaki iki teknisyen olan Olga Kagan ve HBO guo uygulamalı olarak gösterecektir. Bu protokol, yazılı protokolde açıklandığı üzere Lambda red rekombinasyon mekanizmasının eksprese edildiği DDY three 30 suşuna spesifik amplifiye dizilerin hedeflenmesiyle başlar.

Ardından, bakteriyofaj Lambda rekombinasyon sistemini eksprese eden suşu, 2 mL Luria-Bertani (LB) besiyerinde, 32 °C'de ve 180 RPM çalkalamada gece boyunca büyütün. Ertesi gün, gece boyunca büyütülen kültürden 1 mL'yi, 500 mL'lik konik erlen içindeki 70 mL taze LB besiyerine inoküle edin. İnokülumu, OD 600 yaklaşık 0,8 değerine ulaşana kadar 32 °C'de ve 180 RPM çalkalamada büyütün. Erleni 42 °C'deki bir su banyosunda, 15 dakika boyunca 180 RPM'de hafifçe çalkalayarak hücreleri indükleyin.

İndüksiyonun hemen ardından, erleni sallama işlemi eşliğinde en az 30 dakika boyunca buzlu su banyosunda inkübe edin. Hücreleri yazılı prosedürde açıklandığı şekilde topladıktan ve yıkadıktan sonra, hücre peletini 700 µL buz gibi soğuk, steril su içinde yeniden süspanse ederek elektroporasyon yoluyla elektro-kompetan hücreler elde edin. Saflaştırılmış amplikonun 1 µL'sini, 40 µL elektro-kompetan hücrenin içine aktarın.

Hücreler, homolog rekombinasyon ve entegrasyon sonrası elektropore edilir. Etiketi/kaseti kromozoma başarıyla rekombine eden transformantlar, kanamisin direncine göre seçilir; SPA etiketli füzyon proteinlerinin doğru şekilde oluşturulduğunu, SPA etiketinin flag epitoplarına özgü olan Anti-Flag M2 antikoru ile doğrulamak için western blotting için birden fazla transformant seçilir. Gece boyunca büyütülen kültürün 10 mililitresini, 4 litrelik bir erlene konulmuş ve 25 µg/mL kanamisin ile desteklenmiş 990 mililitre taze TB besiyerine aktarın.

Kültürü, OD 600 değeri iki ile üç arasına ulaşana kadar 32 °C'de, 250 RPM sabit hızda çalkalayarak beş ila altı saat boyunca büyütün. Bir litrelik e coli SPA tag kültürünü temiz santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri 4 °C'de, 3.993 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından hücreleri, yazılı protokolde açıklandığı şekilde yeniden süspande edin.

Örnekleri, sonikasyon için buz üzerinde bekletilen steril bir paslanmaz çelik kaba aktarın. Probun ucu örneğin içine daldırın ve üç dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyonun ardından, sonikasyonla elde edilen lizatın santrifüjlenmesinden sonra, örneğin aşırı ısınmadan dolayı soğuması için iki dakika daha bekleyin.

S süpernatantını santrifüj tüpünden 50 mililitrelik bir polipropilen falcon tüpüne dikkatlice aktarın. Numuneyi sıvı azot kullanarak dondurun ve sonikasyon uygulanmış dondurulmuş hücre ekstraktını, gelecekte kullanmak üzere maksimum altı ay boyunca -80 °C'de saklayın. Dondurulmuş sonike hücre ekstraktı için afinite saflaştırmasına başlamak amacıyla tüpü soğuk suya yerleştirin ve TH hücre ekstraktını, üç mikrolitre benzo (bir nükleaz) ile 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu karışıma, noniyonik deterjan Triton X 100 ve 200 µL Anti-Flag M2 agro bead süspansiyonu ekleyin. Tüpü dört derece celsius'ta üç saat boyunca döndürerek içeriği nazikçe karıştırın; üç saatlik döndürme işleminin ardından tüpü 1.700 ×g hızında altı dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminin ardından, gevşek çökelmeyi bozmadan süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice uzaklaştırın.

Peleti kalan SNA içerisinde yeniden süspande edin ve ardından polipropilen bir hazırlama kolonuna aktarın. Eluatın yerçekimiyle akmasını sağlamak için kolonun alt çıkış tıpalarını çıkarın. Ardından, kolonu beş kez 200 µL 1x FC tamponu ile yıkayın ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde TEV ile kesme işlemine geçin.

Kesme işleminin ardından, kolonun hem üst hem de alt kısmını sıkıca kapatın. Gece boyunca 4 °C'de döndürerek kolon içeriğini nazikçe karıştırın. Üst kapağı ve alt tıpayı çıkararak elüatı yeni kolona boşaltın.

Eski kolonu 400 µL 1x Cal Modlin bağlama tamponu ve 150 µL Cal Modlin bağlama boncukları süspansiyonu ile yıkayın. Bağlanan proteini, 1x Cal Modlin elüsyon tamponu kullanarak taze bir eend orph tüpüne 50 µL'lik dört fraksiyon halinde elüe edin.

Elüye edilen fraksiyonu, eşit hacimlerde iki temiz eend orph tüpüne dağıtın. Ardından, her iki tüpün içeriğini bir speed vacuum kullanarak kurutun. Bir tüpteki kurutulmuş elüat, metinde açıklandığı şekilde gümüş boyama jeli çalıştırmak için kullanılırken, diğeri -80 °C'de saklanır.

Kurutulmuş numuneyi kütle spektrometresinde kullanmak üzere, numuneye 50 µL sindirim tamponu ve 0,9 µL 100 mM tris fosfin hidroklorik asit ekleyin; indirgeme aşaması için karışımı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Ardından, numune alkilasyonunu sağlamak için 1 µL 500 mM IDO asetamid ekleyin ve 40 dakika daha karanlıkta inkübe edin. İkinci inkübasyon döngüsünün ardından, karışıma 1 µg tripsin ekleyin. İnkübasyon sonrası numuneyi ya 37 °C'de beş saat ya da oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin.

Tepkimeyi bir mikrolitre asetik asit ekleyerek durdurduğunuzdan emin olun. Ardından, peptidin uç borusuna verimli bir şekilde bağlanması için metinde açıklandığı şekilde Millipore zip tip pipet ucunu hazırlayın. Peptit karışımını 20 kez karıştırın ve yıkama solüsyonunu aspire edip dağıtarak peptit karışımının uçtan yıkanmasını sağlayın.

Peptit karışımının uca verimli bir şekilde bağlanmasını sağlamak için bu işlemi iki kez tekrarlayın; uç, bağlı peptidi içerecektir. Islatma ve dengeleme çözeltisinden 10 µL aspire edin ve temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Elüye edilen örnekler speed vac cihazında kurutulduktan sonra, örnekler hemen kütle spektrometrisi ile analiz edilebilir veya kullanımdan önce -80 °C'de saklanabilir. Bu prosedürde kullanılan mikro kolonlar, yaklaşık 10 cm uzunluğunda üç mikronluk lunar C 18 reçinesi ile doldurulmuştur ve orbitrap cihazı ile aynı hatta yerleştirilmiş bir pro Zion nano elektrospray iyon kaynağına bağlanmıştır. Peptit ayrıştırmaları sırasında yaklaşık 300 nL/dakika hızında stabil bir uç akış hızı sağlamak için bir pro Zion nano akışlı binary HPLC pompası kullanılır; peptit seyreltmesi elde etmek için örnek karmaşıklığına göre bir organik tampon gradyeni oluşturun.

Bu e coli SPA örneği için mobil faz solvent A, %95 HPLC gradyan suyu ve %0,1 formik asit içeren %5 asetonitril'den; solvent B ise %5 HPLC gradyan suyu ve %0,1 formik asit içeren %95 asetonitril'den oluşmaktadır. Kütle spektrometrisi işleminin ardından, spektrumları seaquest gibi bir veri tabanı arama algoritması kullanarak e coli protein dizileri veri tabanına karşı tarayın. Düşük bir yanlış keşif oranı sağlamak için sonuçları star quest gibi bir olasılık algoritması ile istatistiksel olarak filtreleyin. Hem SPA etiketli RNA polimeraz sigma faktörü hem de bilinmeyen fonksiyona sahip yak LA proteini; alfa, beta ve beta prim alt birimlerini içeren çekirdek RNA polimeraz enziminin yanı sıra RNA polimeraz geri dönüşüm faktörü ile spesifik olarak birlikte saflaştırılmıştır. Etiketli RNA polimeraz sigma faktörünün aksine, yak L ek olarak temel bir transkripsiyon terminasyon anti-determinasyon faktörüne bağlanmış olup bu durum transkripsiyonda özelleşmiş bir fonksiyona işaret etmektedir.

LCMS ile, jel üzerinde belirgin olmayan RNA polimeraz Omega alt birimi ile transkripsiyon sonlandırma ve belirleme faktörlerinin yanı sıra USA ve NUSD dahil olmak üzere beraber saflaşan birkaç küçük protein daha tespit edilmiştir. Buna karşılık, etiketli kükürt mobilizasyon mekanizmasının kullanıldığı bağımsız bir deneyde, S-U-F-B-S-U-F-C ve SUFD birbirleriyle beraber saflaşmış olup, bu durum tek bir iskele kompleksi olarak demir-kükürt küme biyosentezine ortak katılımı göstermektedir. Bu temsili örnek, temel biyolojik süreçlere katılan ve önceden iyi çalışılmış, yüksek derecede notlandırılmış bakteriyel MultiPro komplekslerinin, genellikle verimli bir şekilde tanımlanabilecek yeni ilişkili bileşenlere sahip olduğu gerçeğini vurgulamaktadır.

Bu yaklaşım kullanıldığında, SUFB proteininin düşük kopya sayısı, SUFC ve SUFD pull-down deneylerinde gözlemlenen güçlü yoğunluğa kıyasla zayıf sinyal yoğunluğuna yol açmış olabilir; stabil çok birimli protein komplekslerinin kompozisyonunu belirlemek için, yem-av, yem-yem ve av-av ilişkilerinin benzersizliği dikkate alınarak yüksek güvenilirlikli etkileşimlere ko-purifikasyon skorları atanmıştır. Ardından, markoff kümeleme algoritması gibi grafik kümeleme prosedürleri kullanılmıştır. Bölümlenmiş olasılıksal PPI ağından ayrık protein kümeleri tanımlanır.

Olası etkileşim ağları Cytoscape kullanılarak görselleştirilebilir. Proteomik verilerin, genomik yöntemlerle çıkarılan ek fonksiyonel ilişki kanıtlarıyla birleştirilmesi, önceden tanımlanmış e coli proteinlerinin yeni mekanistik rollerinin araştırılmasında kullanılabilir. Burada, e coli'de daha geniş fonksiyonel komşuluklar olarak yer alan protein kompleksleri ve fonksiyonel modüllerden oluşan alt ağlar tanımlanmıştır.

Graham'ın gösterdiği ana hiyerarşik küme, E. coli'nin fonksiyonel olarak yetim ve karakterize edilmiş genleri için mevcut anotasyonlar ile fonksiyonel öngörülerin örüntülerini göstermektedir; sarı ve mavi renkler sırasıyla mevcut ve çıkarımlanan fonksiyonları temsil ederken, gölge yoğunlukları güven puanlarını yansıtmaktadır. Çeşitli komşuluklarla ilişkili biyolojik süreçler sağda belirtilmiştir; eklerde ise entegre fiziksel ve fonksiyonel etkileşim ağı benzerlik puanlarına dayalı temsili bir komşuluğun bireysel bileşenleri gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, E. coli'den gelen stabil protein komplekslerinin kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş afinite saflaştırması yaklaşımı kullanılarak nasıl izole edilebileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Prensip olarak, bu teknik, rekombinasyonun mümkün olduğu herhangi bir türden membran protein komplekslerini veya protein komplekslerini karakterize etmek için uygulanabilir.