Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

Bu video protokolünde, akciğer dokusunun dissosiyasyonunun ardından, gentle max kullanarak yetişkin fare akciğer dokusunun nasıl dissosiye edileceğini göreceksiniz. Kollagenaz d ve DNase I varlığında, tek hücre süspansiyonları 70 mikronluk bir hücre süzgeci kullanılarak filtrelenir, santrifüj edilir ve ileri uygulamalar için süspanse edilir. Merhaba, ben Almanya'daki Mil Biotech'ten Melanie Mlu.

Bugün size GenX disosiyasyon yöntemini kullanarak fare akciğer dokusundan tek hücreli süspansiyon hazırlama için tekrarlanabilir ve otomatikleştirilmiş bir prosedürü göstereceğim. Laboratuvarımızda bu prosedürü, lökosit veya endotel hücrelerinin hazırlanması için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak amacıyla kullanıyoruz. Tamam, hadi başlayalım.

Protokole başlamadan önce, birkaç standart çözeltinin hazırlanması ve hazır bulundurulması gerekir. İlk olarak, Hebes tamponuna ihtiyaç duyacağız. İkinci olarak, mililitrede 100 miligram enzim ve hebes tamponu içeren bir kollajenaz D çözeltisi hazırlanmalıdır.

Üçüncü olarak, mililitre başına 20.000 ünite dase one içeren bir dase one çözeltisi. Son olarak, iki yaygın tampon çözeltisi: pH 7.2'de tipik bir PBS tamponu ve AutoMax durulama çözeltisi ile BSA stok çözeltisinden elde edilen bir PEB tamponu.

Protokolümüze, altı ila yedi haftalık dişi biyopsi faresinden alınan diseke bir akciğer ile başlıyoruz. Akciğerin kalp ve timus gibi bitişik organlardan, efferent ve afferent kan damarlarından, trakeadan ve bağ dokulardan arındırılmış olduğundan emin olun. Eritrositleri uzaklaştırmak için dokuyu PBS içeren bir Petri kabında durulayın.

Tipik olarak, bu yaştaki bir fare akciğeri 110 ile 150 miligram arasında ağırlığa sahiptir. Daha yaşlı hayvanlardan veya diğer fare suşlarından gelen akciğerleri dissosiye etmeyi planlıyorsanız, dokuyu ve tampon çözeltiyi tartın. Tüp başına en fazla 450 miligram doku dissosiye edilebilir.

Akciğer dokusunu, içine 4,9 milliliters heis tamponu eklenmiş nazik bir max C tüpüne aktarın. Akciğer dokusu ve tampona, nihai konsantrasyonu iki milligrams per milliliter olacak şekilde 100 microliters kollajenaz D çözeltisi ekleyin. Şimdi 10 microliters dase ekleyin.

150 mg'dan fazla doku için bir çözelti. 20 µL dase one çözeltisi ekleyin. C tüpünün sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve tüpü ters şekilde gentle max dis üzerine yerleştirin.

Dokunun rotor ile stator arasında olduğundan emin olun. Akciğer programını seçin ve program sona erdiğinde başlat düğmesine basarak çalıştırın. C tüpünü cihazdan çıkarın ve örneği 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, 37 °C'lik bir inkübatörde tüp, max mix tüp rotatörü kullanılarak döndürülmeli veya her beş dakikada bir manuel olarak çevrilmelidir. İnkübasyonun ardından C tüpünü gentle max Associator'a geri yerleştirin ve ikinci akciğer programını çalıştırın. Program çalışırken, kapağı 70 µm gözenekli bir hücre süzgeci ile değiştirerek filtrelenmiş hücreleri toplamak için 50 mL'lik bir tüp hazırlayın. Dissosiyasyon programı sona erdiğinde, tüpteki örnek materyalin dağılımına bağlı olarak, örnek materyali konsantre etmek için tüpü kısa süreliğine santrifüjlemek isteyebilirsiniz.

Disosiye edilen hücreler, C tüpünün septum mühürlü kapağı üzerinden pipetleme yapılarak tüpten alınabilir. Uygun bir 1000 mikrolitre pipet ucu kullanarak, daha büyük partikülleri veya agregatları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonu hücre süzgecine uygulanır. Çözelti süzüldükten sonra, filtrelenen hücreleri çöktürmek için hücre süzgecine beş mililitre oda sıcaklığında ek HBES tamponu ekleyerek yıkayın.

50 mililitrelik tüpü 300 GS'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatanı aspire edin ve hücre peletini oda sıcaklığındaki istediğiniz hacimdeki PEB tamponunda yeniden süspande edin.

Süpernatanı dekante etmeyin. Artık sonraki uygulama aşamalarına geçebilirsiniz. Fare akciğer dokusunun bu prosedür kullanılarak disosiyasyonu, yüksek oranda canlı lökosit ve endotel hücre elde edilmesini sağlayacaktır.

Elde edilen tek hücre süspansiyonları CD 45 PE, CD 1 46 FITC veya CD 31 FITC ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Bu grafik; CD 11 C mikroboncuklar, bir minimax separatör ve iki MS kolonu kullanılarak dendritik hücrelerin zenginleştirilmesini göstermektedir. Tamam. Size, gentle mix disosiyasyon ve C tüplerini kullanarak fare akciğer dokusundan standart bir şekilde tek hücre süspansiyonlarının nasıl hazırlanacağını göstermiş oldum.

Bu yöntem, doku disosiyasyonunun verimli ve genel bir şekilde gerçekleştirilmesine olanak tanır. Bu prosedür uygulanırken, akciğerin düzgün bir şekilde diseke edilmesi ve dokunun diseksiyondan hemen sonra işlenmesi önemlidir. Hazırlanan tek hücre süspansiyonları daha sonra ileri deneyler için kullanılabilir.

Örneğin, hücrelerin manyetik olarak işaretlenmesi ve ardından lökositlerin veya endotel hücrelerinin ayrıştırılması. Tamam, bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.