Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Bu prosedür, yüksek kaliteli RNA şablonundan sentezlenmiş cDNA ile başlar. cDNA önce floresan boya Cy3 ile işaretlenir. İşaretleme reaksiyonu tamamlandığında, işaretlenmiş cDNA saflaştırılır, izole edilir ve işaretleme reaksiyonunun kalitesi değerlendirilir.

İşaretlenmiş CDNA daha sonra bir mikroarray üzerine hibridize edilir. Hibridizasyonun ardından, örneklerdeki gen ekspresyonunun bağıl seviyelerini belirlemek için arrayler analiz edilir. Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Sağlık Bilimleri Okulu'nda Dr. Jennifer Freeman'ın laboratuvarından Sam Peterson.

Daha önce, zebrafish embriyolarından RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini ve bu RNA'nın nasıl cDNA'ya dönüştürüleceğini göstermiştik. Bugün, global gen ekspresyon profillerini incelemek amacıyla bu cDNA'nın etiketlenmesi ve bir zebrafish oligonükleotid mikroarray platformuna hibridizasyonu prosedürünü göstereceğiz. Genellikle bu prosedürü, bir toksine maruz kalma sonucunda ortaya çıkan diferansiyel gen ekspresyonunu incelemek için kullanırız.

Öyleyse başlayalım. Mikroarray deneyi, etiketlemede kullanılan floresan boya Cy3'ün fotodegradasyonunu önlemek için düşük ışıklı bir ortam gerektirir. cDNA'yı Cy3 ile etiketlemeye başlamak için BioPrime Array CGH Genomik Etiketleme Sistemi'nin şu bileşenlerini çözün: 2,5x rastgele primer tamponu, 10X dCTP karışımı ve nükleaz içermeyen su. Ayrıca, 1 mM stok Cy3 etiketli dCTP'yi çözün; çözdükten sonra, reaktifleri kısaca santrifüjleyin ve 0,6 ml'lik kalın duvarlı bir tüpte birleştirin.

40 µL cDNA'nın 500 ng'ı, 2,5 x rastgele primer tamponu ve toplam hacmi 86 µL'ye tamamlamak için nükleazsız su ekleyin. İyi karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin, ardından reaksiyonu bir termosiklet cihazında 100 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyon sonunda reaksiyonu derhal bir buz banyosuna aktararak 10 dakika bekletin.

Ardından, exo DNA polimerazı dondurucudan çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Daha sonra reaksiyon tüpüne 10 µL 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL 1 mM SI 3D CTP ve 2 µL XO cleanout DNA polimeraz ekleyin, iyice karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin. Son olarak, reaksiyonu 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin ve etiketleme tamamlandığında bir termosikletör kullanın.

İşaretli cDNA'yı temizleme ve çöktürme işlemine geçin. İşaretli cDNA'yı temizlemeye başlamak için, bir MicroCon kolonunu 1,5 mililitre tüpün içine yerleştirin.

Kolona 300 µL 0.1 XSSC ekleyin ve ardından etiketleme reaksiyonunu ekleyin. Kolonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.100 G'de santrifüjleyin. Akış sıvısının açık pembe renkli olabileceğine dikkat edin.

Akış sıvısını atın ve kolona 300 µL daha 0.1 X SSC ekleyin. Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.100 g'de santrifüj işlemini tekrarlayın. Akış sıvısını tekrar atın ve kolona ek olarak 300 µL 0.1 X SSC ekleyin; bu son yıkama işleminden sonra 4 °C'de 12 dakika boyunca 16.100 g'de santrifüj yapın.

Akış sıvısı berrak olmalı ve işaretli cDNA kolonda pembe renkte görünmelidir. İşaretli cDNA'yı elüe etmek için bu son yıkamadan gelen akış sıvısını tekrar atın. Kolona 100 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Kolonu mikro santrifüj tüpünden çıkarın ve yeni bir tüpe ters çevirerek yerleştirin.

Ardından, ters çevrilmiş kolonu 4 °C'de, 2.300 G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. İşaretli cDNA, tüpün dibindeki suyun içinde çözünür. Elde edilen cDNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak NanoDrop ND 1000 spektrofotometre kullanarak kontrol edin.

DNA konsantrasyonunu hesaplayın ve eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde boya inklüzyonunu değerlendirin. cDNA yeterince işaretlenmişse, işaretli cDNA karışımını çöktürmek için yeni bir tüpe altı mikrogram ekleyip pH 5.2'de 3 M sodyum asetatın 0,1 x hacminde ve 1 x hacminde isopropanol ile oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu noktaya kadar olan tüm adımların minimum ışık ortamında gerçekleştirildiği göz önünde bulundurulmalıdır. Ardından, örneği oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16,100 G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminden sonra, pembe renkli olan DNA peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice dökün.

Son olarak, 500 µL %70 etanol ekleyerek yıkama yapıldı ve hafifçe ters çevirerek karıştırıldıktan sonra 16.100 G'de beş dakika santrifüj edildi. Oda sıcaklığında süpernatan uzaklaştırıldı, tüp ters çevrildi ve peletin beş dakika boyunca kuruması sağlandı. İşaretlenmiş cDNA hibridizasyon için hazırdır.

Hibridizasyona başlamadan önce, nimble gen hibridizasyon sistemini açın ve 42 °C'ye dengelenmesini bekleyin. İşleme, işaretli CD NA peletini beş µL nükleaz içermeyen su içerisinde çözerek başlayın. Eşlik eden yazılı protokolde belirtildiği üzere, Roche Nimble Gen Hybridization kitinden hibridizasyon tamponu hybrid A ve hizalama oligosu hibridizasyon bileşenlerini, toplam hacim 18 µL olacak şekilde ekleyin.

İçeriği dipte toplamak için iyi karıştırın ve tübü kısa süreliğine santrifüj edin. Ardından, tüpü beş dakika boyunca 95 °C'de tutarak işaretlenmiş CDNA'yı denatüre edin. Diziler hazır olana kadar tüpü hemen nimble gen hibridizasyon sistemine aktarın.

Mikrodizilerin dikkatli bir şekilde taşınması ve saklanması gerektiğini unutmayın. Roche NimbleGen dizileri, oda sıcaklığında, kurutucu ile birlikte karanlıkta saklanır. Diziyi hassas karıştırıcı hizalama aracına yerleştirin.

PMA T'ye X bir karıştırıcıyı yükleyin ve yapışkan şeridi pens ile çıkarın. Dizi ve karıştırıcı yüklendikten sonra, PMA T'yi güvenli bir şekilde kapatın. Ardından, PMA T'deki delikten karıştırıcıya baskı uygulayarak diziyi ve karıştırıcıyı PMA T'den ayırın.

Son olarak, dizinin mühürlendiğinden emin olmak ve varsa hava kabarcıklarını gidermek için mikserin dış çevresine bir brayer ile baskı uygulayın. Ardından, cDNA örneğini diziye yüklemek amacıyla, dizi mikser kompleksini ısıtılmak üzere hibridizasyon sistemine yerleştirin. Yer değiştirme pipetini yavaşça ve sabit bir basınçla kullanın.

Karıştırıcının merkezindeki dolum portuna 15 µL işaretli örnek ekleyin. Port deliklerindeki fazla örnekleri silin ve bunları yapışkan şeritlerle kapatın. Ardından mandalı kapatın.

Şimdi nimble gen hibridizasyon sisteminde program B'yi kullanarak hibridizasyon solüsyonunu karıştırmaya başlayın. Mikro-dizinin 16 ila 20 saat boyunca hibridize olmasına izin verin. Hibridizasyon tamamlanmaya yaklaştığında, mikro-dizi yıkanacak ve taranacaktır. Gene picks 4,000 B dizi tarayıcısını açarak tarama işlemine hazırlanın ve yaklaşık 15 dakika boyunca ısınmasını bekleyin.

Ardından, ekteki yazılı protokolde belirtildiği gibi bir A, bir B iki ve üç yıkama tamponlarını hazırlayın. Yıkama tamponu bir A'yı 42 °C'ye kadar ısıtın, ancak diğer tamponları oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponu bir A ısındığında, onu bir kaba dökün.

Bir lam rafını yıkama tamponu bir B içerisine daldırın. Şimdi dizi karıştırıcı kompleksini nimble gen hibridizasyon sisteminden çıkarın ve jig içerisine yerleştirin. Düzeneneği önceden ısıtılmış yıkama tamponu bir A içerisine daldırarak yıkama işlemini başlatın ve karıştırıcıyı lamdan soyarak dikkatlice çıkarın. Ardından diziyi jigden çıkarın ve yıkama tamponu bir A içerisinde 15 saniye boyunca çalkalayın. Diziyi hızla yıkama tamponu bir B içerisine daldırılmış bir lam rafına aktarın ve lam rafını iki dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.

Ardından lam rafını yıkama tamponu ikiye aktarın ve bir dakika boyunca çalkalayın. Son olarak, lam rafını yıkama tamponu üçe aktarın ve 15 saniye boyunca çalkalayın. Diziyi lam kurutma santrifüjüne aktarıp santrifüjleme sonrası iki dakika boyunca döndürerek yıkama işlemlerini tamamlayın.

D ışığa ve ozona duyarlı olduğu için diziyi hemen tarayın; diziyi barkod aşağı gelecek şekilde Gene Picks 4,000 B dizi tarayıcısına yükleyerek taramaya başlayın. Donanım ayarları iletişim kutusunda, 532 nanometre lazer için PMT değeri 500 olarak ayarlayın, gücü %100'e, piksel boyutunu beş mikrona, ortalanacak satır sayısını bire ve odak konumunu sıfır mikrona ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, dizinin ön izlemesini yapın.

Taranacak bir alan seçin ve ardından taramayı gerçekleştirin. Tarama tamamlandığında, görüntü histogramını kontrol edin. İdeal olarak, normalleştirilmiş sayımların E eksi beş değerinin 65.000 doygunluk sınırında olması gerekir; bu da özelliklerin yaklaşık %1 ila %2'sinin doygun olduğu anlamına gelir.

Normalize edilmiş sayımlar 1 E⁻⁵'ten küçükse, PMT kazancını artırın ve lamı yeniden tarayın. Normalize edilmiş sayımlar 1 E⁻⁵'ten büyükse, PMT kazancını düşürün ve lamı yeniden tarayın, görüntüyü kaydedin ve veri normalizasyonu ile yoğunluk değerlerinin hesaplanması için bir veri analiz programı kullanın. Etiketleme reaksiyonu rutin olarak en az 10 µg etiketli cDNA sağlar.

Boya inklüzyonu, nükleotid/SI 3 oranının A 260/A 550 oranının 23,15 ile çarpımına eşit olduğu basit bir baz boya oranı kullanılarak hesaplanabilir. Başarılı bir reaksiyon, 50 ile 80 arasında bir değerle sonuçlanacaktır. Kabul edilebilir bir hibridizasyonda, özelliklerin %1 ila %2'si doygunluğa ulaşacaktır.

65.000 doygunluk sınırında 1 E-5 normalize sayım. PMT değeri 500 civarına ayarlandığında, mikrodizinin taranmış görüntüsü incelenerek ve hizalanmış oligoların yoğunluğu dizideki diğer özelliklerle karşılaştırılarak hibridizasyon kalitesi nitel olarak da değerlendirilebilir. Taranmış görüntü, dizi alanı içinde herhangi bir belirgin leke veya toz zerresi olup olmadığını tespit etmek için de incelenmelidir.

Sonraki analizlerde, örneklerdeki gen ekspresyonunun göreceli seviyelerini belirlemek ve diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için analiz verilerinizi görüntülemek amacıyla bir saçılım grafiği kullanılabilir. Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, en uygun doğrunun anlamlı derecede dışına çıkacaktır. Tamamlayıcı bir prosedürde, zebra balığı embriyolarından RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini ve sentetik cDNA'ya nasıl dönüştürüleceğini gösterdik. Burada ise, global gen ekspresyon profillerini incelemek için cDNA'nın bir oligonükleotit mikroarray platformunda nasıl işaretleneceğini ve hibridize edileceğini gösterdik.

Bu prosedürü uygularken, her zaman yüksek kaliteli CD NA kullanmayı unutmayın ve bölge üç boyasını doğrudan ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde başarılar dileriz.