Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'nde, Shannon Fisher laboratuvarından Erica Kgi. Ben de Fisher Laboratuvarı'ndan Chris Weber. Ve ben Shannon Fisher.

Bugün size, zebrafish transgenezi kullanarak enhancer elementlerinin fonksiyonlarını analiz etme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, iskelet gelişiminde önemli olan genlerin transkripsiyonel düzenlemelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım.

Aday genleri çevreleyen kodlamayan dizileri belirlemek için, uc SC genom tarayıcısında bir izlek (track) olarak erişilebilen fast cons algoritmasını kullanıyoruz. Öncelikli olarak iskelet gelişimi sırasında eksprese edilen genlerle ilgileniyoruz, ancak aynı yaklaşım erken gelişimde eksprese edilen herhangi bir geni incelemek için de kullanılabilir. Burada gösterilen örnekte, korunmuş dizileri belirledik.

İnsan bumper geni çevresindeki aralıkta, komşu genlere kadar olan tüm aralığı inceleriz ve kodlama yapmayan dizilerin yaklaşık olarak en üst %5'ine karşılık gelen, düşük boyut spesifik bir log skor eşik değeri belirleriz. Diziler seçildikten sonra, her bir diziyi insan genomik DNA'sından amplifiye etmek için Primer3 kullanarak primerler tasarlanır; primerler, korunmuş bölgeyi ve her iki yanındaki 30 veya daha fazla baz çiftini amplifiye edecek şekilde seçilmelidir. İnsan genomik DNA'sı kullanılarak, yüksek kaliteli bir polimeraz ile ilgili bölge amplifiye edilir ve amplifiye edilen ürünün bir ekspresyon vektörüne klonlanması için standart laboratuvar moleküler biyoloji prosedürleri uygulanır.

Bu protokolde kullanılan vektör PG wc FOS GFPA gateway'dir. Hedef vektör. Vektör oluşturulduktan sonra transpozisyon yapılması belirtilmiştir.

Transpozisyon için gerekli olan enzim, deneysel enjeksiyonlar öncesinde Ambion'dan M message M machine kiti ve PGB 600 plazmidi kullanılarak in vitro ortamda transkribe edilir. Her bir transpozaz serisinin etkinliğini, mouse socks. 10 enhancer gibi bilinen bir enhancer enjekte ederek test edin.

Enjeksiyon hazırlıkları için, mikroenjeksiyonda kullanılan iğneleri Sutter P 97 mikropipet çekici ile 1,2 milimetre dış çaplı filament kapiler camdan çekin. Bozulmamış korionları delmek için temiz bir jilet ve mikrometre lamı kullanarak keskin bir konikliğe sahip güçlü bir uç sağlayan bir program kullanın. Uçları, bir stereo mikroskop altında elle yaklaşık 15 mikrometre dış çapa gelene kadar kırın.

İğneler, kapalı bir saklama kabında bir gün boyunca muhafaza edilebilir. Mikroenjeksiyonlar gerçekleştirilmeden önceki gün, zebra balığı popülasyonunu standart koşullar altında 14 saatlik ışık içeren düzenli bir ışık-karanlık döngüsünde tutun. Balıkları, zamanlanmış çiftleşmeler için küçük üretim tanklarında hazırlayın.

Mikroenjeksiyonların yapılacağı sabah, ışık döngüsü başladıktan kısa bir süre sonra, her tanka paralel sıralar halinde üç dişi veya iki erkek yerleştirin. Yumurta üretimi için erkekleri ve dişileri, temiz sistemle işlem görmüş suda birleştirin. Balıkları sık sık kontrol edin ve iyi senkronize edilmiş gruplar elde etmek için yumurtaları üretimden sonraki birkaç dakika içinde toplayın.

Sabah boyunca, lateks ampul takılmış geniş ağızlı 5,25 inçlik bir cam pastoret pipet kullanarak taze balık gruplarını birleştirmeye devam ederek yumurta üretimini iki ila üç saat boyunca sürdürün. Toplanan embriyoları, kısmen embriyo ortamı ile doldurulmuş 60 x 15 milimetrelik Petri kaplarına 50'şerli gruplar halinde ayırın. Toplama saatini her kabın kapağına not edin.

Toplanan her embriyo grubu için, yumurta toplama işlemleri arasında, enjekte edilmemiş kontrol grubu için 50 embriyo içeren bir kap ayırın. Aşağıdaki malzemeleri bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak taze enjeksiyon solüsyonları hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon iğnelerini tutucu kaplara yerleştirin ve 1,5 ila 2 µL enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.

Her iğnenin geniş ucuna pipetle 500 nanolitre damla damlatarak yapılır. Sıvı, kılcal hareket yoluyla uca doğru çekilecektir. Her bir enjeksiyon solüsyonu için en az iki iğne hazırlayın.

Doldurulmuş iğneyi, üretici talimatlarına göre bir azot tankına yapılandırılmış ve bağlanmış olan pnömatik bir pico pompa veya benzeri bir basınç enjektörünün el tipi iğne tutucusuna yerleştirin. Tipik olarak 120 milisaniyelik bir enjeksiyon süresiyle, mikrometre lam üzerindeki mineral yağına püskürtülen damlacıkların çapını ölçerek enjeksiyon hacimlerini kalibre edin.

20 PS basınç uygulayarak, 6 ila 10 kat büyütmeli bir stereo mikroskop altında yaklaşık bir nanolitre hacminde bir damlacık elde edeceğim. Embriyoyu bir çift ince pensle sabit tutun ve enjeksiyon iğnesini sabit bir basınçla korion üzerinden geçerek tek hücreli veya erken iki hücreli evredeki bir embriyonun vitellusu içine itin; iğne ucunu vitellusta blastomerlerin hemen altına konumlandırın, yaklaşık bir nanolitre enjeksiyon solüsyonu boşaltın ve iğneyi geri çekin. Enjekte ettiğimiz her bir konstrükt için 200 veya daha fazla embriyo kullanıyoruz; enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra döllenmemiş yumurtaları, hasarlı embriyoları, başarısız enjeksiyonları veya blastomerlerde fenol kırmızısı bulunmayan embriyoları ayıklayarak embriyoları sınıflandırın.

Ardından, gözlemler için uygun zaman gelene kadar embriyoları ve embriyo ortamını 28,5 °C'de inkübe ederiz. Şimdi size, zebrafish embriyosunda dokuya özgü GFP ekspresyon paternleri oluşturan enhancer elementlerinin bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz. Kemik veya kıkırdakta eksprese edilen genleri inceliyoruz.

Burada, döllenmeden üç gün sonra kranial fasiyal kıkırdakta ekspresyonu düzenleyen acan geni yukarısındaki bir enhancer elementi örneği yer almaktadır. Burada ise kemik hücrelerinde ekspresyonu düzenleyen, bu kez bumper genine ait bir başka enhancer bulunmaktadır. Beşinci günde, tanımladığımız birçok enhancer arasında, gene göre konumu ile ekspresyon düzenlemesi arasında çok az korelasyon olduğunu görmekteyiz.

Test edilecek diziler seçilirken, bir enhancer'ın, bu embriyoda görüldüğü gibi, bir genin yüzlerce kilobaz yukarısında veya aşağısında ya da intronlardan birinde olabileceğini hatırlamak önemlidir. Dizilerin önemli bir kısmı, dokuya özgü ekspresyonu regüle etmiyor gibi görünmektedir. Bunlar genellikle çok az floresans gösterir veya ektopik ekspresyon için yaygın iki bölge olan epidermis ve iskelet kasında birkaç dağınık hücreye sahip olabilir.

Dizilim korunumluğu yoluyla potansiyel enhancer elementlerini nasıl belirleyeceğinizi ve zebrafish'te Mozaik transgenezi ile işlevlerini nasıl test edeceğinizi size gösterdik. Bu prosedürü uygularken, enjeksiyonlar için kullandığınız DNA ve RNA'nızın kalitesini incelemeniz önemlidir. Ayrıca, özellikle yalnızca küçük bir hücre grubunda ekspresyon bekliyorsanız, enjekte ettiğiniz tüm embriyoları dikkatle incelediğinizden emin olun.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.