Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Drosophila melanogaster içindeki gelişmekte olan organların rekonstrüksiyonlarını gerçekleştirmek için, pupanın kendi içindeki ışık yayılımını en iyi tanımlayan ileri modelin belirlenmesi gerekir. Prosedür, beyaz bir ön pupanın seçilmesi ve pupanın anterior-posterior ekseni tüpe paralel olacak şekilde bir kapiler tüpün ucuna yapıştırılmasıyla başlar. Küçük bir kapiler tüp bir miktar floresan boya ile doldurulur ve pupa kılıfının içine yerleştirilir.

Dikkatli bir eksen ayarının ardından, pupa 360 derece döndürülür. Farklı açılarda görüntüler alınır. Elde edilen floresan transmisyon aydınlatma verileri, organ gelişimini görüntülemek için kullanılacak ileri modelin belirlenmesinde kullanılır.

Merhaba, benim adım Claudia; Massachusetts General Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi'ndeki Yardımcı Biyoloji Merkezi'ndeyim. Ben Harvard Tıp Fakültesi Paramount Laboratuvarı'ndan Ula Petou. Ben de Münih Teknik Üniversitesi ve Heliman Merkezi Münih'teki Biyolojik ve Tıbbi Görüntüleme Enstitüsü'nden Daniel Rozanski. Bugün size Oph Melano Casta'nın tüm vücudunun üç boyutlu rekonstrüksiyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, pupil durumu sırasında gelişen organların in vivo görselleştirilmesi için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Başlamadan önce, optik projeksiyon tomografisinin bazı teknik yönlerinin burada anlatılandan daha ayrıntılı şekilde açıklandığı ve bu videodan önce izlenmesi gereken herhangi bir eşlikçi video bulunmadığını lütfen unutmayın.

Ek olarak, diğer video hazırlanan dokuların veya daha büyük hayvanların organlarının görüntülenmesini açıklamaktadır. Bu videoda yer alan tüm deneyler için drosophila transgenleri kullanılacaktır. Bunlar, tükürük bezlerinde eksprese edilen EL A gal four, yetişkin kanat ve göğsünün larval öncül dokularında eksprese edilen apteris gal four ve floresan protein üreten transgendir.

Gal four adı verilen U-A-S-G-F-P ve white 1118 suşlarına yanıt olarak, UAS transgenlerini taşıyan floresan olmayan kontrol erkekler, dokuya özgü GFP ekspresyonu sağlamak amacıyla GAL four transgenlerini taşıyan bakire dişilerle çaprazlanır. GFP çaprazlamaları, üzerine fırıncı mayası serpilmiş standart sinek besiyerinde 8 ila 10 bakire dişi ve erkek kullanılarak kurulur. Flakonlar, nemlendirilmiş bir inkübatörde, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsü altında 25 °C'de muhafaza edilir.

Çaprazlama başlangıcından iki gün sonra, ebeveynler taze bir viyale aktarılır ve beş ila altı gün sonra, PUI'lar viyali beyaz PrepU ile doldurmaya başlar. GFP ekspresyonu, floresan bir diseksiyon mikroskobu altında seçilir. Beyaz öncü PUI'ların seçilmesi, hayvanların yaklaşık bir saat boyunca beyaz kalmaları nedeniyle, hayvanların uygun evrelemesini sağlar.

Pupilasyonun ardından, bu yapılar pigmente olur veya kahverengiye döner. GFP eksprese eden pupae, ıslak bir boya fırçası kullanılarak tüplerden nazikçe toplanır ve bir Petri kabındaki bir damla su veya PBS içerisine yerleştirilir; ancak otofloresan maddelerden tamamen arındırılmaları için silinmelidirler. Boya fırçası kullanıldıktan sonra, artık tomografik görüntüleme için hazır hale gelmiş olmalıdırlar.

Eğer PrepU'nun doğru gelişim evresine ulaşması için olgunlaşmaya devam etmesi gerekiyorsa, ıslak bir kağıt havlu ile birlikte bir Petri kabında veya temiz bir gıda tüpünde bekletilebilirler. Bu, görüntüleme için yeterli nemi ve uygun gelişimi sağlayacaktır. PrepU, 800 mikron çapındaki bir cam kapiler tüpün iç yüzeyine yapıştırılmalıdır.

Pupanın posterior ucunu hızlı yapıştırıcı ile boyayın ve ön pupanın yapıştırılan yüzeyini, sineğin anterior-posterior ekseni tüple paralel olacak şekilde tüpün içine doğru yönlendirin. Hayvanın anterior kısmı kapiler tüpten dışarı taşacaktır. Kapiler tüp artık mikroskobun rotasyonel tablasına sabitlenmiştir.

Dikey konumda, tüpün dönme ekseni görüntüleme CCD'sinin piksel sütunlarıyla paralel olacak şekilde döner tablasının eğim eksenini ayarlayın. Sineğin konumu optimize edildikten sonra görüntüleme işlemine geçin. Bu örnekte, floresan tutum bezlerine sahip hayvanlar görüntülenecektir; tutum bezlerinde GFP ekspres eden sinekler, EAG four ve U-A-S-G-F-P stokları arasındaki bir çaprazlamadan elde edilebilir.

Sabitlenmiş bir ön pupa ile başlayarak ön pupayı bir uyarma demetiyle aydınlatın ve GFP floresan sinyalini toplayın. Transillumine yöntemiyle, ön pupayı dikey ekseni boyunca 360 derece döndürün ve transillumine görüntüleri edinin. Her görüntü 10 derecelik bir rotasyona karşılık gelir.

Toplam görüntüleme süresi, floresans miktarına ve uyarım ışınının şiddetine bağlıdır. Tipik süreler bir dakika civarındadır. Bu örnekte, kanat imaginal disklerinde GFP eksprese eden bir DSO pupası görüntülenecektir.

Bu pupa, Aus GAL four ve U-A-S-G-F-P stoklarının çaprazlanmasıyla elde edilen bir şişeden toplanabilir. Pre-pupa, daha önce açıklandığı şekilde monte edilir. Ancak, bu deney için görüntüleme süresi yaklaşık sekiz saat olduğundan, ortamın nemli kalması ve oda sıcaklığında tutulması kritik önem taşır. Hayvanın dehidrasyonunu ve ölümünü önlemek için, ilgili dokudaki floral fours'ların sönümlenmesini engellemek ve hayvanın lazer ışınıyla yanmamasını sağlamak amacıyla eksitasyon ışınının üzerine bir perde yerleştirilir; daha önce olduğu gibi, eksitasyon ışını ile aydınlatma yapılır ve GFP floresan sinyali trans-aydınlatma yoluyla toplanır.

Pre-pupa, dikey ekseni boyunca tamamen döndürülür. Veri toplama sırasında döndürme işlemi sadece bir dakika sürer ve farklı zaman aralıklarında tekrarlanır. Gelişim sırasındaki kanatların hızlandırılmış (time-lapse) bir görüntü serisini oluşturmak için, saatte 100 görüntü hızında en az altı saat boyunca veri toplanabilir.

Hasarı veya fotobeyazlamayı önlemek için toplam ışık maruziyetinin bu dekansla kontrol edilmesi hayati önem taşır. Bu video, PrepU aşaması ile pupilla baş kaçınması arasında elde edilen görüntüleri göstermektedir. Üç boyutlu görüntü yeniden oluşturulurken, difüzyonla tahmin edilemeyen ve hesaba katılması gereken güçlü bir ileri saçılma meydana gelir.

Rekonstrüksiyonu gerçekleştirmek için ışık yayılımının ileri saçılma modeli belirlenmelidir. Basitlik adına absorbsiyon ihmal edilmiştir. Saçılma miktarı deneysel olarak test edilir. Bunu yapmak için, standardize floresan özelliğe sahip yabancı bir nesne, floresan özelliği olmayan beyaz 1118 ön pupa içerisine yerleştirilir ve ardından ileri model verilerini oluşturmak için taranır. İşleme, 100 mikronluk bir silika kapiler tüpü PS 5.5 floresan boya ile doldurarak başlayın.

Kılcallık etkisini kullanarak, kapiler tüpü pupaya anterior eksenle 45 derecelik bir açıyla itin, PrepU'yu bir kapiler tüpe monte edin ve daha önce açıklandığı gibi döner tabla üzerinde uygun şekilde konumlandırın. Şimdi, ön pupayı düşük sayısal açıklıklı bir lens ile uyarım lazer ışınıyla aydınlatın ve ön pupanın floresan trans-aydınlatma görüntülerini toplayın. Daha önce açıklandığı gibi, verileri açık teorik ileri modele uydurmak için MATLAB yazılımı kullanılır. Rekonstrüksiyon sürecini kolaylaştırmak için, iletim denklemine yönelik firm e yaklaşımı, ileri saçılma rejimini tanımladığı ve aynı zamanda deneysel verilere uyum sağladığı için seçilmiştir.

Doğru ileri model belirlendikten sonra, tükürük bezlerini yeniden yapılandırabilir ve zaman ayarlı tomografik rekonstrüksiyonlar elde edebiliriz. Serbest boşluk tomografisi kullanmayı planlıyorsanız, indeks eşleme için konfigürasyon algoritmaları da kurulabilir. İlk olarak, gelişimin erken evrelerindeki tükürük bezlerinin 3D bir rekonstrüksiyonunu gösteriyoruz.

Karşılaştırma amacıyla, tükürük bezlerinin histolojik boyaması, rekonstrüksiyonların histoloji ile iyi bir korelasyon gösterdiğini ortaya koymaktadır. Kanat imajinal disklerinin gelişimini gösteren bu zaman atlamalı film, tek bir canlı örnekten elde edilmiştir. Karşılaştırma için kanat disklerinin aynı zaman noktalarındaki histolojik boyaması, rekonstrüksiyonların histoloji ile iyi bir korelasyon gösterdiğini göstermektedir.

Size, Drosophila in vivo bünyesindeki üç boyutlu yapıları zaman içinde görüntülemek için bir sistemin nasıl kurulacağını göstermiş olduk. Bu yöntem, Drosophila'daki morfojenizi takip etmemize ve kanat gelişimini altı ardışık saat boyunca izlememize olanak tanır. Bu prosedürü uygularken, drosophila içindeki ışık yayılımı için doğru ileri modelin seçilmesi kritik önem taşır.

Bu yöntem, oph pupil evreleri boyunca organ gelişimine ışık tutmak için histolojik tekniklerle birlikte kullanılabilir ve benzer boyutlardaki farklı organizmaların incelenmesi için modifiye edilebilir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.