Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Bu teknikte, cam lameller inert ve biotinli peg moleküllerinin bir karışımı ile fonksiyonelleştirilir. Bu fonksiyonelleştirilmiş yüzeyle bir akış hücresi oluşturulur ve bir TIRF mikroskobu üzerine yerleştirilir. Biyotinillenmiş yuvarlanan çember şablonları, multivalent streptavidin kullanılarak yüzeye tutturulur.

Substratlar, replikasyon zon proteinleri ve nükleotidlerin eklenmesiyle kopyalandığında, ortaya çıkan çift sarmallı DNA lamine akışla uzatılır ve bir interkale boya kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'ndeki Antoine Van Elsinkel laboratuvarından Nathan Tanner. Ben de Van Elsinkel laboratuvarından Joe Laro.

Bugün size, tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı DNA replikasyonunun floresan görüntülemesi için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bireysel replikasyon komplekslerinin koordineli DNA sentez aktivitelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, TBS tamponunda on kat fazla oligo ekleyip 65 °C'ye kadar ısıtarak ve ardından primerin düzgün şekilde tavlanmasını sağlamak için ısıtıcı bloğu kapatıp yavaşça soğumaya bırakarak biotinlenmiş kuyruk oligoyu M 13 tek zincirli DNA'ya tavlayın. Primer M 13 hazır olduğunda, bunu dNDP'ler ve magnezyum klorür içeren 64 nM T7 DNA polimeraz ve T7 replikasyon tamponu karışımına ekleyin ve reaksiyonu 37 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda, 100 mM EDTA ile reaksiyonu durdurun.

Ardından, doldurulmuş ürün DNA'sını fenol izoamil alkol kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve TE tamponu veya diğer uygun bir saklama tamponu ile diyalize edin; herhangi bir kalıntı primerleştirilmiş M 13'ü geri kazanmak için her bir organik fazı geri ekstrakte edin. Diyaliz sonrası DNA konsantrasyonunu UV-Vis spektrofotometre ile belirleyin. Şablon hazırlamanın tek bir iterasyonu, yüzlerce ila binlerce tek molekül deneyi için yeterli nanomolar konsantrasyonda şablon sağlayabilir.

DNA hazır olduğuna göre, fonksiyonelleştirilmiş lamelden kapak camlarının hazırlanmasına geçiniz. Replike edilecek DNA, Amil Lane ile fonksiyonelleştirilmiş cam lamel kapaklara tutturulur; Amil'in Oksi grubu cama bağlanarak biotinillenmiş peg moleküllerinin bağlanması için bir amin grubu bırakır. Bu kaplama, yüzeye olan spesifik olmayan bağlanmanın azaltılmasına yardımcı olur.

Cam lamellerini iyice temizlemek için lamelleri boyama kavanozlarına yerleştirin ve kavanozları etanol ile doldurup sonikasyona tabi tutun. 30 dakika sonra kavanozları durulayın ve bir molar potasyum hidroksit ile doldurup 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun; her iki yıkama işlemini de tekrarlayın. İlk fonksiyonelleştirme reaksiyonu için tüm su kalıntıları giderilmelidir.

Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Ardından kavanozlara sine reaktifini ekleyin ve iki dakika boyunca çalkalayın.

Ardından, fazla miktarda su ile söndürün. Sonra, lamel camları fırında 110 °C'de 30 dakika pişirerek kurutun. Daha sonra, yaklaşık %0,2 ağırlık/hacim oranında PEG karışımını hazırlayın; lamel camların ayrılmasını sağlayacak bir cam lamel cam ara parçası dahil olmak üzere, kuru silanize lamel cam üzerine 100 µL pipetleyin.

Üzerine ikinci bir lamini yerleştirin. Lamineleleri üç saat boyunca PEG çözeltisinde inkübe edin. Ardından her bir lamin çiftini ayırın ve su ile kapsamlı bir şekilde yıkayın.

Sadece bir tarafı peg ile kaplanacağı için lamine camların fonksiyonelleştirilmiş tarafının yukarıda kalmasına dikkat edin. Son olarak, lamine camları basınçlı hava ile kurutun ve bir desikatörde vakum altında saklayın; yüzeyler en az bir ay boyunca stabil kalır. Böylece, onlarca lamine cam bir parti halinde hazırlanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilir.

Lamel camlar hazır olduğunda, tek molekül deneyi için akış hücresi monte edilebilir. Sonraki adımlarda hava kabarcıklarını gidermek amacıyla, öncelikle BSA içeren 20 ila 25 mililitre bloklama tamponunu bir desikatöre yerleştirin. Ardından, 25 mikrolitre streptavidini 100 mikrolitre PBS içinde seyreltin ve çözeltiyi peg ile fonksiyonelleştirilmiş bir lamel camın yüzeyine yayın; hücrenin diğer parçalarını hazırlarken, streptavidinin yüzey biyotinine bağlanması için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Kapak lam inkübe olurken, çift taraflı bandın arkasından, akış odasını oluşturmak için kullanılan kuvars lamın boyutuna uygun bir parça kesin. Akış odasının taslağı bant üzerine çizilebilecek şekilde, tüp deliklerinin konumlarını bant üzerine kurşun kalemle işaretleyin. Delikleri işaretledikten sonra, işaretlemelerin etrafına iki milimetre genişliğinde bir dikdörtgen çizin.

Bu dikdörtgen akış kanalı olarak hizmet edeceğinden, kenarları düz yaptığınızdan ve tüp giriş ile çıkışının etrafında boşluk bıraktığınızdan emin olun. Şimdi, yapıştırıcının kanala taşmadığından emin olmak için düz ve temiz kesikler yaparak, işaretli bandı çizilen taslağa göre kesin. Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi düzeneğinden kalan yapıştırıcıları temizlemek için kuvars lamı aseton kullanarak iyice temizleyin.

Kanal taslağının en uygun hizalamasını bulun. Yapışkanlı arka yüzün bir tarafını çıkarın ve bandı dikkatlice kort lamı üzerine yerleştirin. Giriş ve çıkış deliklerinin açık kalması gerektiğinden, bandı doğru şekilde hizalamaya özen gösterin.

Ardından, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 mm çapındaki borunun uygun uzunluktaki parçalarını hazırlayın. Borunun ucunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesmek, borunun hazne tabanına düz bir şekilde baskı yapmasını önlemeye yardımcı olur. Sonraki adımlarda akış hücresine kolayca takabilmek için boruları deney tüpü raflarına asın.

Bu aşamada lamelle inkübasyon tamamlanmıştır. Strep-avid ENC kaplı lamelli suyuyla iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Lamelin sadece bir tarafı fonksiyonelleştirildiği için ters çevirmemeye dikkat edin.

Son olarak, bandın diğer tarafındaki koruyucuyu çıkarıp kuvars lamı lamelin üzerine yerleştirerek akış hücresinin montajını tamamlayın. Yapışkan kısmında hapsolmuş havayı dışarı itmek için lamelin üzerine hafifçe bastırın. Bu işlem, akış kanalına hava kabarcığı girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.

Hazerin yan kısımlarını epoksi ile mühürleyin. Kesilmiş tüpleri kuartz deliklerine yerleştirin, epoksi ile sabitleyip mühürleyin ve birkaç dakika kurumaya bırakın. Epoksi mühür kuruduğunda, yüzey bloklama işlemine başlayın.

21 gauge bir iğne kullanarak, Degas bloklama tamponunun bir kısmını tüplerden birinin içinden geçirin. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyon deneyine geçmeden önce haznenin en az yarım saat inkübe edilmesini sağlayın.

Akış hücresi bloke edildikten sonra, hücreyi mikroskop tablasına yerleştirin. Tabla klipsleriyle hücreyi sabit tutun ve akış kanalının y ekseni boyunca hizalandığından emin olun. Akış hücresi çıkış tüpünü, daha geniş çaplı bir bağlantı tüpü kullanarak şırınga pompasına bağlayın.

Giriş ucunu bloklama tamponuna yerleştirin ve tüpteki havayı boşaltmak için şırıngayı geri çekin. Çıkış tüpüne hafifçe vurmak, akış hücresinde hapsolmuş hava kabarcıklarını temizlemeye yardımcı olacaktır. Şimdi DNA'yı ekleyin; stok DNA kalıbını bir mililitre bloklama tamponu içinde 25 picomolar düzeyine seyrelterek, DNA'nın yüzeyi iyi bir şekilde kaplamasını sağlamak amacıyla 30 dakika boyunca 0,025 mililitre/dakika gibi orta bir akış hızında hücreye aktarın.

DNA hazneye girdikten sonra, en az 200 akış hücresi hacmi kadar bloklama tamponu yıkamasıyla fazla DNA'yı yıkayın. Tüm serbest DNA'dan kurtulmak için lazeri ve kamerayı açın. Soğutmalı CCD, kullanılmadan önce hedef sıcaklığa ulaşmalıdır.

Fazla DNA yıkandıktan ve replikasyon tamponu gazdan arındırıldıktan sonra, replikasyon reaksiyon karışımı nükleotidleri, DTT ve cytoxin içeren replikasyon tamponunu hazırlayın. Ardından proteinleri ekleyin ve nazikçe karıştırın. Daha sonra reaksiyon karışımını akış hücresine aktarın.

Akış hızı, iki milimetre genişliğinde ve 100 mikrometre yüksekliğinde bir akış kanalı için çift sarmallı DNA'yı germeye yetecek düzeyde olmalıdır; 0,04 milliliters per minute bu işlem için uygundur. Karışımın hazneye girmesi için yaklaşık 10 dakika süre tanıyın.

Görüş alanını kanalın kenarına getirin ve odaklama için yüzeye yakın olduğunuzdan emin olmak ve görüntülemeye başlamak için yapışkan malzemeye odaklanın. Lazer gücünü, mikroskop odağını ve turf açısını ayarlayın. Boyanmış DNA'nın fotolize uğramasını önlemek için gücü düşük tutun.

DNA replikasyon hızına bağlı olarak, saniyede bir ila beş kare hızında birkaç dakika boyunca görüntüleme yapın. Daha uzun replikasyon yörüngeleri elde etmek için işlemi tekrarlayın veya reaksiyon karışımının neredeyse tamamı hücreye pompalandığında, diğer görüş alanlarını görmek için hücreye cyt içeren daha fazla tampon akıtarak yeni bir alana geçin. Farklı replike moleküllerin birden fazla görüntüsünü almak, üretkenlik tayini için istatistik sağlar.

Yuvarlanan halka replikasyon analizinde, öncü zincir sentezi, halkayı ve yüzeyi birbirine bağlayan kuyruğu uzatır; kuyruk, geciken zincir polimerazı tarafından çift zincirli DNA'ya dönüştürülür ve gösterilen laminer akışla gerilir. Burada, 532 nanometre uyarımında cyt orange ile bir görüş alanı örneği yer almaktadır.

Küçük floresan lekeler, bağlanmış replike olmamış substratlardır. Ürünlerin aşırı uzunluğuna ve alan başına düşen ürün sayısının fazlalığına dikkat edin. Tipik bir görüş alanı, boyanmış DNA'nın büyüyen parlak çizgileri olarak görünen çok sayıda replike olan molekülü gösterecektir. 37 °C'deki E Coli deneyleri, yüzey yoğunluğuna bağlı olarak alan başına beş ila 50 molekül verir.

T7 replikasyon bölgesi çok daha verimli bir şekilde başlar ve bir alandaki moleküllerin %50'sinden fazlasını replike eder. Bu kadar yüksek bir yoğunlukta, burada görüldüğü gibi tekil molekülleri ayırt etmek zordur. Bu nedenle T7 deneyini daha düşük protein konsantrasyonlarında veya yüzey yoğunluğunda gerçekleştirin. E. coli ve T7 deneylerinden elde edilen tipik replike moleküllere ait Chime grafikleri, e coli ve T7 moleküllerinin zamana karşı çizilmiş son nokta yörüngelerini içerir; replikasyon hızlarını elde etmek için yörüngeler doğrusal regresyon ile uydurulmuştur ve bu örnekte hızlar e coli için saniyede 467,1 baz çifti ve T7 için saniyede 99,4 baz çiftidir.

T7 için, tek molekül yörüngelerinin tekil Gauss eğrileriyle uydurulan hız dağılımları, e coli için saniyede 535,5 ± 39 baz çifti ve 75,9 ± 4,8 baz çifti şeklinde bir ortalama vermektedir. T7 için, replikasyon ürünlerinin uzunluk dağılımları, üretkenliği elde etmek amacıyla tekil üstel azalma ile uydurulmuştur; bu değer e coli için 85,3 ± 6,1 kilobaz çifti ve G7 için 25,3 ± 1,7 kilobaz çiftidir. Böylece, koordineli DNA replikasyonunun tek moleküllerle nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, lamel kapakların uygun şekilde fonksiyonelleştirilmesinin ve temiz, düz akış kanallarının oluşturulmasının önemli olduğunu unutmayın. Lazer gücünü düşük tuttuğunuzdan emin olun ve uzun DNA'ların fotoklevajını en aza indirin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.