Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bu video, lineerleştirilmiş ve kimyasal olarak modifiye edilmiş lambda DNA'sının geniş alanlı optik mikroskopi ile DNA replikasyonunun görselleştirilmesine yönelik bir protokolü göstermektedir. DNA, fonksiyonelleştirilmiş bir cam lam üzerine tutturulur. DNA'nın serbest ucu boncuklarla işaretlenir ve DNA, laminer akış ile gerilir.

Replikasyon başladığında, öncü zincir uzamaya başlar ve gecikmeli zincir kıvrılma nedeniyle kısalır. Düşük kuvvetlerde çift zincirli ve tek zincirli DNA arasındaki uzunluk farkının belirgin olması, replikasyon sırasında DNA dönüşümlerinin doğrudan gözlemlenmesine olanak tanır. DNA konstrüktünün uzunluğu, boncuğun konumunun takip edilmesiyle izlenir ve bu sayede DNA replikasyonunun hızı ve süreci hassas bir şekilde belirlenebilir.

Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'ndeki Anto one Vanian ve Charles Richardson laboratuvarlarından Ari Ulrich. Bugün size tek moleküler düzeyde DNA replikasyonunun görüntülenmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarlarımızda bu prosedürü, DNA sentezi sırasında gerçekleşen enzimatik aktiviteleri incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedürün başında, doğrusallaştırılmış bakteri faji Lambda DNA'sı, bir replikasyon çatalı, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, biyotinillenmiş bir çatal kolu ve bir çatal primeri oluşturmak için dizileyici oligonükleotidler ile modifiye edilir. Biyotinillenmiş çatal ön kolu, 5' ucuna bağlı bir biyotin içerir; bu da DNA kalıbının akış hücresi yüzeyine sabitlenmesine olanak tanır.

Lambda DNA, bir boncuk bağlanması için yüksek afiniteli bir immünotag görevi gören bir diggen ve moyetisi içeren başka bir oligonükleotidin tavlanmasıyla daha da modifiye edilir. Replikasyon çatalını oluşturmak için, dizileri bu videoya eşlik eden yazılı protokolde bulunan birkaç oligonükleotidin yanı sıra lambda DNA temin edin. Bu oligonükleotidler; biyotinlenmiş bir çatal kolu, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, bir çatal primeri ve bir lambda tamamlayıcı diggen ve ucunu içerir; lambda tamamlayıcı çatal kolunun ve lambda tamamlayıcı digogen ucunun beş prime uçlarını T4 polinükleotid kinaz kullanarak fosforile edin.

Ardından, fosforile edilmiş lambda tamamlayıcı çatal kolunu, biyotinile edilmiş çatal kolunu, çatal primerini ve lambda DNA'sını 10'a 10'a 100'e 1 molar oranında karıştırın. T4 DNA Ligaz tamponunda, oligonucleotidlerin ve T4 DNA ligazın karışıma uygun şekilde bağlanmasını sağlamak için karışımı 65 °C'de beş dakika boyunca ısıtın ve ısıtma bloğunu kapatarak oda sıcaklığına yavaşça soğutun, ardından iki saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında T4 DNA Ligaz, oligonucleotidler ile lambda arasındaki çentiklerin kapatılmasını katalize edecektir.

Son olarak, fosforile edilmiş lambda komplemanter digogenin ucunu T4 Ligaz tamponu içerisinde DNA replikasyon kalıbına ekleyerek DNA'yı anilleyin; karışımı 45 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından ısıtıcı bloğu kapatarak oda sıcaklığına yavaşça soğutun. Karışıma T4 DNA ligaz ekleyerek fosforile edilmiş lambda komplemanter digogenin ucunu DNA replikasyon kalıbına ligeyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Nihai DNA replikasyon kalıbı artık kullanıma hazırdır. Tassell aktive edilmiş manyetik boncukların DNA replikasyon kalıbına bağlanabilmesi için, bu boncukların digogenine özgü bir FAB fragmanı ile fonksiyonelleştirilmeleri gerekir.

Bu işleme başlamak için, boncukların stok çözeltisini yeniden süspande edin ve 400 microliterini bir einor tüpüne aktarın. Tüpü bir manyetik separatöre yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar inkübe edin. Ardından, süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın. Antikor bağlama için toal gruplarını aktive etmek amacıyla bir milliliter boid tamponu ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın.

Süpernatanı tekrar manyetik ayırıcı yardımıyla uzaklaştırın. Ardından, 240 µL FAB fragmanı ekleyin ve boncukları 400 µL borat tamponu içinde yeniden süspande edin. İyice karıştırın ve bir rotatör üzerinde 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, boncukları manyetik ayırıcı kullanarak ayırın ve süpernatantı uzaklaştırın. Boncukları bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın ve dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika inkübe edin, ardından tamponu manyetik ayırıcı kullanarak uzaklaştırın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlanır.

Serbest tosyl gruplarını bloke etmek için, tris tamponu içeren bir mililitre BSA ekleyin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, manyetik bir ayırıcı kullanarak boncuklardan tamponu uzaklaştırın, tamponla iki kez yıkayın ve porsiyonlara ayırın. Kullanım için, replike edilecek DNA, Amil lane ile fonksiyonelleştirilmiş cam lamellerine tutturulur.

Amin silanın oksiler grubu cama bağlanarak, biyotinli peg molekülleriyle bağlanma için bir amini serbest bırakır. Bu kaplama, yüzeye yönelik spesifik olmayan bağlanmanın azaltılmasına yardımcı olur. Cam lamelleri tamamen temizlemek için onları boyama kavanozlarına yerleştirin, kavanozları etanol ile doldurun ve sonikasyon uygulayın.

Kavanozları 30 dakika boyunca durulayın ve 1 molar potasyum hidroksit ile doldurup 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun; her iki yıkama işlemini tekrarlayın. İlk fonksiyonelleştirme reaksiyonu için tüm su kalıntılarının giderilmesi gerekir. Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Kavanozlara sine reaktifini ekleyin ve iki dakika boyunca çalkalayın. Ardından, bol miktarda su ile durulayın.

Ardından, lamelleri fırında 110 °C'de 30 dakika boyunca kurutun. Sonrasında, yaklaşık %0,2 ağırlık/hacim oranında peg karışımını hazırlayın. Cam lamel ara parçası içeren biyotinillenmiş peg, lamellerin ayrılmasını sağlayacaktır; kuru silanize bir lamelin üzerine 100 µL pipetleyin.

Üzerine ikinci bir lamel yerleştirin. Lamelleri PEG çözeltisi içinde üç saat boyunca inkübe edin. Ardından her bir lamel çiftini birbirinden ayırın ve suyla iyice yıkayın.

Sadece tek tarafı peg ile kaplanacağı için, lamine camların fonksiyonelleştirilmiş tarafının yukarıya gelecek şekilde tutulmasına dikkat edin. Son olarak, lamine camları basınçlı hava ile kurutun ve vakum altında saklayın. Bir desikatörde yüzeyler en az bir ay boyunca stabil kalır. Böylece, onlarca lamine cam tek seferde hazırlanabilir ve gerektiğinde kullanılabilir.

Kapak lamlar hazırlandıktan sonra, tek molekül deneyi için akış hücresi monte edilebilir. Tek molekül deneyi; fonksiyonelleştirilmiş bir kapak lam, çift taraflı bant, kuvars lam ve tüpler kullanılarak oluşturulan basit bir akış hücresi ile gerçekleştirilir. Her tek molekül deneyi için bir akış hücresi hazırlanır.

Beş mililitre bloklama tamponu ve 20 mililitre çalışma tamponunu karıştırarak başlayın ve sonraki adımlar için hava kabarcıklarını gidermek amacıyla karışımı bir desikatöre yerleştirin. Ardından, PBS içindeki strp din çalışma çözeltisinden 100 mikrolitreyi peg fonksiyonel hale getirilmiş lam yüzeyine yayın ve strp din'in yüzey biyotinine bağlanmasını sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bu sırada, kuvars lamın boyutuna uygun bir çift taraflı bant parçası kesin ve bant üzerindeki boru deliklerinin konumlarını işaretleyin.

Üç milimetre genişliğinde bir merkez kanal ve her iki deliği de içeren dikdörtgenler çizerek akış odasını taslaklandırın. Akış odaları, iki girişli ve iki çıkışlı y şeklinde kanallarla tasarlanabilir. Şimdi, işaretli bandı çizilen taslağa göre, hiçbir yapışkanın kanala taşmadığından emin olmak için düz ve temiz kesikler yaparak kesin.

Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi yapımından kalan yapıştırıcıyı temizlemek için kuvars lamı aseton kullanarak iyice temizleyin. Kanal taslağının en uygun hizalamasını bulun. Yapışkanlı bandın bir tarafındaki koruyucuyu çıkarın ve bandı dikkatlice kuvars lam üzerine yerleştirin.

Giriş ve çıkış deliklerinin tıkanmaması için bandı düzgünce hizaladığınızdan emin olun. Ardından, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 mm iç çapındaki tüplerin uygun uzunluklarda kesimlerini hazırlayın. Tüpün ucunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesin; böylece tüp, hazne tabanına düz bir şekilde baskı yapmayacaktır.

Sonraki adımlarda akış hücresine kolayca takılabilmesi için tüpleri test tüpü raflarına asın. Bu aşamada, lamel inkübasyonu tamamlanmış olmalıdır. Lameli suyla iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun.

Lamine camlağın sadece bir yüzeyi peg ile fonksiyonelleştirildiği için, camlağı ters çevirmemeye dikkat edin. Bant desteğinin diğer tarafını çıkarıp kuvars lamı lamine camlağın üzerine yerleştirerek akış hücresinin montajını tamamlayın. Yapışkanda hapsolmuş tüm havayı dışarı itmek için lamine camlağa hafifçe bastırın. Bu işlem, akış kanalına hava kabarcığı girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.

Hazerin kenarlarını epoksi ile mühürleyin. Kesilmiş boruları kuvars üzerindeki deliklere yerleştirin ve epoksi ile sabitleyerek mühürleyin. Birkaç dakika kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, oda yüzeyini bloke etmek için 21 gauge bir iğne kullanarak DGAs bloklama tamponunun bir kısmını tüplerden birinin içinden geçirin. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyon deneyine geçmeden önce odanın en az 30 dakika inkübe edilmesini sağlayın. DNA kalıp fonksiyonelleştirilmiş boncuklar ve akış odası hazırlandığında, tek molekül deneyi gerçekleştirilebilir.

Başlamak için, akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin. Hücreyi tabla klipsleriyle sabitleyin ve akış kanalının CCD kamera ile aynı hizada olduğundan emin olun. Daha önce hazırlanmış hava yayını şırınga pompasına ve akış hücresinin çıkış borularına bağlayın.

Daha geniş çaplı konnektör tüpler kullanarak, akış hücresinin giriş tüplerini bloklama tamponuna yerleştirin ve tüplerdeki hava kabarcıklarını gidermek için şırıngayı geri çekin; akış hücresine sıkışmış hava kabarcıklarını temizlemek için çıkış tüplerine hafifçe vurun. Tüm hava kabarcıkları giderildikten sonra, giriş tüplerinden birini bir iğne ile tıkayın ve çıkış tüplerinden birini 180 derece büküp yapışkan bantla sabitleyerek mühürleyin. Hücreye DNA eklemeden önce, stok DNA kalıbını bir mililitre DGAs one x bloklama tamponunda 10 picomolar olacak şekilde seyreltin. DNA'nın yüzeyi iyi kaplamasını sağlamak için kalıbı orta düzey bir akış hızında hazneye aktarın.

Stok boncuk çözeltisini, mililitre başına 2 ila 4 x 10⁶ boncuk olacak şekilde seyreltin. Bir mililitre DGAs 1x bloklama tamponu ekleyin. Ardından karışımı vorteksleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.

Seyreltilmiş boncuk çözeltisini hücreye akıtın. Boncuklar eklendikten sonra akışı kapatın ve hücrenin dengeye ulaşmasını bekleyin. Ardından her iki çıkış tüpünü kapatın.

Hazne kapalı değilken tüplerde yapılan herhangi bir değişiklik, boncuklar üzerinde güçlü bir kuvvet uygulayarak bağlanan DNA moleküllerini koparacak basınç dalgalanmalarına neden olacaktır. Boncukların yüklenmesi için kullanılan giriş tüpünü, ikinci giriş tüpünü kullanarak bir iğne ile tıkayın. Akış hücresini, bloklama tamponu yıkama çözeltisinin 1x DGAs konsantrasyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkamaya başlayın.

Yüzeye spesifik olmayan şekilde yapışmış boncukları temizlemek için sahneye hafifçe vurarak sarsın ve kontrol edin. Boncuklar DNA'ya bağlıdır. Akış yönünü değiştirmeyi deneyin.

Serbest boncuklar yeterince uzaklaştırıldıktan sonra, akışı kapatın ve haznenin dengeye ulaşmasını bekleyin. Metin protokolünde belirtildiği üzere replikasyon proteinleri içeren taze reaksiyon karışımı hazırlayın. Açık olan çıkış tüpünü kapatın ve giriş rezervuarını yeni hazırlanan reaksiyon karışımına yönlendirin.

Enzimatik reaksiyona geçmek için hızlı basınç değişimlerini önlemek amacıyla çıkışı yavaşça açın. İlk olarak, protein çözeltisini DNA'ya etkili bir bağlanma sağlamak için orta düzeyde bir akış hızında hücreye akıtın. Akışı kapatın ve hücrenin dengeye ulaşmasını bekleyin.

Çıkış tüplerini kapatın ve reaksiyon karışımını içeren tüpü değiştirin. Yıkama işleminden sonra serbest proteinleri uzaklaştırmak için, DGAs yıkama tamponu içeren tüp ile bölmeyi yıkayın. Akışı tekrar kapatın ve bölmenin dengeye ulaşmasını bekleyin.

Çıkış tüplerini kapatın ve yıkama tamponu içeren tüpü değiştirin. T7 replikasyon tamponu içeren tüpü yerleştirin; T7 replikasyon tamponu, replikasyon reaksiyonunun başlamasını tetikleyen magnezyum klorür içerir. Bu protokolde açıklanan koşullar altında, DNA bağları üzerinde üç piko Newton'luk bir sürükleme kuvvetine karşılık gelen 0,012 mililitre/dakika akış hızını kullanın.

Boncuklar ile yüzey arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için görüntüleme öncesinde akış hücresinin üzerine nadir toprak elementli bir kalıcı mıknatıs yerleştirin. Fiber aydınlatıcıyı, 10 x objektif ve CCD kamera ile mikroskop görüş alanının yakınına, 10 derece ile mikroskop tablasına paralel olan bir geliş açısıyla konumlandırın. Bağlı boncuk kullanılarak boncuk görüntüleme odağındaki kontrastı artırmak için karanlık alan aydınlatması uygulanır.

Düşük bir kare hızında 20 ila 30 dakika boyunca veri toplama işlemini başlatın. Başarılı bir deneyde, 100 boncuk eş zamanlı olarak gözlemlenebilir. Deney, öncü zincir DNA sentezini gösteren çok sayıda iz sağlamalıdır.

DNA açılma ve polimerizasyon hızlarını ve prosesivitesini ölçmek için, öncelikle boncukların kesin konumlarının belirlenmesi gerekir. Bu konumları iki boyutlu Gaussian fonksiyonları ile fit edin. İzleme yazılımı kullanarak her karedeki boncuk konumunu takip ederek yörüngeyi görselleştirin.

Ardından, hız verilerini elde etmek için herhangi bir grafik yazılımı kullanarak boncuk konumunu zamana göre grafiğe dökün. Grafikleri doğrusal regresyonla uydurun ve prosessiflik için eğimi hesaplayın. Bir kısalma olayının başlangıcından sonuna kadar olan toplam DNA uzunluğunu belirleyin.

Tüm tekil ölçümleri birleştirin ve verileri sırasıyla Gauss ve tek eksponansiyel fonksiyonlar kullanarak fit ederek hız ve üretkenlik dağılımlarını grafiğe dökün. Size tek molekül düzeyinde DNA replikasyon hızlarının ve prosesivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, kuvvetin ve laminar akıştan kaynaklanan belirli etkilerin, replikasyon proteinlerinin enzimatik aktivitelerini etkilemediğinden emin olmak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.