Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

Merhaba, ben Andrea Balbo. National Institutes of Health bünyesindeki Peter Shucks grubunda çalışıyorum. Bu videoda, analitik ultrasentrifüj örnek hücresinin montajı, yüklenmesi ve rotor hizalamasına yönelik prosedürlerimizi size göstereceğiz.

Hadi başlayalım. Toplanmış. İşte bir analitik ultrasantrifüj örnek hücresinin bileşenleri: Hücre gövdesinin içine yerleştirilmiş, iki pencere düzeneği arasında sandviç şeklinde konumlandırılacak olan 12 milimetrelik çift sektörlü kömür alanlı, epoksi merkez parçası bulunmaktadır. Her bir pencere düzeneği; bir pencere contası, bir pencere astarı ve pencere tutucusunun içinde tutulan bir pencereden oluşur.

Ardından bu parçalar, kama yuvaları gövde namlusunun içindeki kama ile hizalanarak hücre gövdesinin içine kaydırılacaktır; bir gövde contası ve ardından bir vida halkası ile numune hücresi 120 ile 140 inch pounds arasındaki bir tork basıncıyla kapatılacaktır. Numunenizi yükledikten sonra, tarama artefaktlarını, sızıntıları ve deneyler sırasında kırılmaları önlemek için iki gövde tapa contası ve bir gövde tapası ile hücrenin yükleme delikleri kapatılacaktır; tüm bileşenlerin temiz, kuru, tozsuz ve mümkün olan en iyi durumda olması hayati önem taşır, sık sık kontrol edin ve gerektiğinde değiştirin. Ayrıca şunlara da ihtiyacınız olacaktır: bir analitik ultrasantrifüj, titanyum dört delikli rotor, bir laboratuvar terazisi, okunabilir kadranlı bir tork anahtarı ve tork standı, bir karşı ağırlık ve karşı ağırlık kütleleri, bir düz uçlu tornavida, bir pens, uzun konik pipet ucu takılmış 200 µL pipetör, hizalama araçları ve spin kaplama yağlayıcısı.

Örnek hücresinin yapımına iki pencere düzeneğini bir araya getirerek başlıyoruz. İlk olarak, pencere tutucunun altına bir pencere contası yerleştirin. Ardından, pencere astarını veya bazen pencere yastığı olarak adlandırılan parçayı, astarın açıklığı tutucunun kama kanalının karşısında hafif bir açıyla duracak şekilde pencere tutucunun içine konumlandırın.

Ardından pencereyi tutucuya yerleştirin ve pencere üzerindeki işaretleme çizgisini pencere tutucusunun kama kanalıyla hizalayın. Pencerenin her iki yanındaki en uç kenarlara hafifçe bastırın. Örnek hücresinin düzgün şekilde mühürlendiğinden ve doğru şekilde çalıştırıldığından emin olmak için, vida halkasındaki gövde contasını hafifçe kaplıyoruz.

Spin coat yağlayıcısı ile, başparmağınız ve işaret parmağınız arasında çok küçük bir miktar spin coat yayın. Vida halkası dişlerini, spin coat ile ince ve görünmez bir tabaka halinde kaplayın. Aynı şekilde gövde contasını da kaplayın.

Görünen tüm yağlayıcıyı silin. Örnek hücresi montajına başlamak için, penceresi size bakacak şekilde yukarı dönük olan bir pencere düzeneğini, kama kanalını gövde kemasına hizalayarak hücre gövdesine doğru kaydırın.

Merkez parçasının kama yuvasını gövde kamasıyla hizalayın ve gövde içindeki pencere düzeneğinin üzerine nazikçe düşmesini sağlayın. Merkez parçasını hücre gövdesine itmek için asla herhangi bir alet kullanmayın. Bu durum, merkez parçasında kalıcı hasara yol açarak deneylerde sızıntı oluşmasına neden olabilir.

İkinci pencere düzeneğini, pencere orta parçaya bakacak ve sizden uzaklaşacak şekilde döndürün. Kama yuvasını gövde kamasıyla hizalayın ve orta parçanın üzerine doğru kaydırın. Gövde contasını üzerine yerleştirin.

Ardından, "out" kelimesi görünecek şekilde bir vidalı halka yerleştirin. Bunu parmaklarınızı kullanarak yapın. Daha sonra bir hizalama aracı kullanarak vidalı halkayı elle sıkın.

Bazen merkez parça, yuva namlusuna kolayca girmez. Önce hizalayıp ardından ikinci pencere düzeneğini üzerine yerleştirebilirsiniz. Pencere düzeneğine hafifçe aşağı doğru basınç uygulayarak.

Her ikisini aynı anda hücre yuvasına kaydırabilirsiniz. Bu sayede, merkez parçasına doğrudan baskı uygulamaktan kaçınmış oluruz. Hücreyi toz, tüy ve parmak izleri açısından kontrol etmek için şu an uygun bir zamandır.

Ayrıca, merkez parçası ile pencereler arasında hala hava olduğunun göstergesi olan Newton halkalarını fark edeceksiniz. Bunlar, vida halkası yukarıda ve "out" kelimesi görünür durumdayken torklama işleminden sonra kaybolacaktır. Örnek hücresini hücrenin içine tamamen yerleştirin.

Tork standının tork pensi. Tork standı koluna sabit basınç uygulayarak hücreyi sabit tutun. Tek bir sürekli hareketle, vida halkasını 120 ile 140 inch pounds arasına sıkıştırın.

Tork standı kolunu bırakın ve örnek hücresini dikkatle çıkarın. Rutin olarak, 12 milimetrelik merkez parçanın her bir sektörüne 400 microliters hacminde yükleme yaparız. 200 microliter pipette kullanarak, örnek hücresini yükleme delikleri üstte ve vida halkasındaki "out" kelimesi görünecek şekilde konumlandırın.

Pipet ucunu yükleme deliklerinden sol merkez parça sektörüne yarıya kadar itin ve 200 µL referans çözeltiyi yavaşça boşaltın. Aynı pipet ucunu ve aynı tekniği kullanarak, dikkatli ve yavaş bir şekilde toplam 400 µL olacak şekilde işlemi bir kez daha tekrarlayın. Sağ merkez parça sektörünü 400 µL örnek çözeltisi ile doldurun.

Referans ve örnek çözeltilerin hacimlerinin birbirine mümkün olduğunca yakın olması zorunludur. Pipet ucunun pipete sıkıca yerleştirilmesi, çözeltilerin yavaşça alınması ve boşaltılması, hava kabarcığı oluşumunun önlenmesi ve her iki çözelti için aynı pipet ucunun kullanılması; hücreyi mühürlemek için hacimlerin eşit tutulmasına yardımcı olur.

İki adet kırmızı gövde tapa contasını, orta parça ile alüminyum gövde arasında dikkatlice konumlandıklarından emin olarak her bir yükleme deliğine sıkıca yerleştirin. Her bir yükleme deliğini bir gövde tapa ile kapatın ve küçük düz uçlu bir tornavida ile elle sıkın. Rotoru yüklemeden önce, karşı ağırlık ile karşı ağırlığın karşısındaki hücrenin ağırlıklarının birbirine 0.5 gram kadar yakın olduğundan emin olun.

Sıfırlanmış bir terazi ile başlayın. İlk olarak, karşı denge ağırlığının karşısındaki konumda yer alacak olan örnek hücresini tartın. Örnek hücresi ağırlığını çıkarmak için teraziyi daralayın.

Ardından karşı ağırlığı tartın. Burada karşı ağırlığın, örnek hücresinden 4,193 gram daha hafif olduğu görülmektedir. Dört gramlık bir karşı ağırlık seçin ve üst kısımdan dışarı taşmadığından emin olarak karşı ağırlığın bağlantı deliğine vidalayın.

Final ağırlığın 0.5 gram dahilinde olduğundan emin olmak için denge ağırlığını yeniden tartın. Dört delikli bir rotor kullanarak, beyaz okun görünür olduğundan ve santrifüj kuvveti yönüne baktığından emin olacak şekilde denge ağırlığını dördüncü konuma yerleştirin. Bir hizalama aracı kullanarak, ağırlığın rotorun içinde tamamen aşağı indiğinden emin olun.

Dengeleme numune hücresini, gövde tıpaları rotorun merkezine bakacak ve vida halkası üzerindeki "out" kelimesi görünecek şekilde yerleştirin. Bir hizalama aracı kullanarak, hücrenin rotorun içinde tamamen aşağı indiğinden emin olun. Rotorun altından bakınız.

İç kısmı hizalayın. Bir hizalama aracı kullanarak, rotorun merkezine en yakın olan işareti karşı ağırlıktaki çizimle hizalayın. Aynı şekilde, ikinci konumdaki örnek hücresini de hizalayın.

Tüm hücreler hizalandıktan sonra, rotor santrifüj haznesine yerleştirilmeye hazır hale gelir.