HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Bu prosedür, HIV eksprese eden jerk CAT T hücreleri ile enfekte olmamış primer T hücreleri arasındaki virolojik sinapslar aracılığıyla GFP etiketli HIV'nin transferini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme yöntemini kullanmaktadır. Hücreden hücreye transfer testi, HIV gag IG FP'nin (HIV 1'in enfeksiyöz floresan bir klonu) yüklendiği ve HIV gag IG FP eksprese eden transfect edilmiş jerk kedi hücreleri ile başlar. Transfect edilmiş jerk kedi hücreleri daha sonra C-M-T-M-R etiketli enfekte olmamış primer T hücreleri ile karıştırılır ve GFP etiketli HIV'nin virolojik sinaps boyunca transferinin gözlemlenebileceği bir görüntüleme haznesine yerleştirilir.

Elde edilen veriler, T hücresi virolojik sinapsları boyunca HIV transferinin detaylarını ortaya çıkarmak için görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Mount Sinai Tıp Fakültesi Tıp Bölümü'ndeki Ben Chen laboratuvarından Benjamin Dale. Ben de UC Davis Tıp Merkezi'ndeki NSF Biyofotonik Merkezi'nde Dr. Thomas Huser laboratuvarında görev yapan Greg McNerney.

Ben de Dr. Thomas Huser'ın laboratuvarından Deanna Thompson. Bugün size canlı konfokal mikroskopi kullanarak HIV-1'in hücreden hücreye transferini görselleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürde, JERK hat hücreleri, HIV-1'in enfeksiyöz bir moleküler klonu ile transfekte edilir; bu işlem yalnızca sertifikalı biyogüvenlik alanlarında çalışan eğitimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmelidir.

Burada gösterilen protokol, seviye iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç doku kültürü odalarında gerçekleştirilebilir. Görüntüleme tesislerinde enfeksiyöz HIV ile çalışılması, yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanmalıdır. Donör hücre olarak kullanılacak jerk kedi hücrelerini mililitre başına 2 × 10⁵ ile 8 × 10⁵ hücre arasındaki bir konsantrasyonda muhafaza edin.

Jerk cat kültüründe, mililitrede 8x10⁵ hücreden fazla olan medya hücre konsantrasyonu, transfeksiyon verimliliğinde azalmaya neden olur. Prosedüre başlamak için, eşlik eden yazılı protokolde açıklanan amax nucleo affection yöntemini kullanarak 5x10⁶ jerk cat hücresini HIV gag IGFP viral plazmidi ile transfekte edin ve hücrelerin gece boyunca toparlanmasına izin verin. Periferik kan mononükleer hücreleri, tam insan kanı buffy coat'larından FICO yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile saflaştırılır.

Primer CD4+ T hücreleri, bir CD4+ T hücresi izolasyon kiti kullanılarak negatif seçilim yoluyla periferik kan mononükleer hücrelerinden saflaştırılır. Negatif seçilimli CD4+ T hücreleri manyetik bir kolondan toplanır ve mililitre başına 10 ünite rekombinan insan IL-2 eklenmiş, %10 FPS içeren PMI ortamında kültüre edilir; ayrıca izole edilen primer CD4+ T hücreleri alikotlara ayrılarak kriyojenik dondurma kapları yardımıyla dondurulabilir. Dondurma kapları, minimum üç ila dört saat boyunca -70 °C'lik bir dondurucuya yerleştirilir.

Hücreler daha sonra uzun süreli saklama için sıvı azota aktarılır. Jurkat hücreleri transfekte edildiğine ve hedef birincil CD4 pozitif T hücreleri izole edildiğine göre, transfeksiyonu takip eden günde hücrelerin temizlenmesi ve etiketlenmesi işlemine geçiniz. Jurkat hücreleri artık enfeksiyöz floresan HIV konstrüktünü eksprese etmektedir.

Enfeksiyöz örneklerle çalışırken, önü kapanan bir laboratuvar önlüğü ve iki çift eldiven giyeriz. Transfekte edilen hücrelerdeki hücresel debrisleri, yüksek paket yoğunluklu bir ortam üzerinden santrifüj ederek uzaklaştırın. Öncelikle, 15 mililitrelik konik bir tüpün tabanına 1,5 mililitre fial pack dağıtın.

Ardından, transfect edilmiş jerk hat hücrelerini 5 mL hacmindeki PMI ortamımızla birlikte gradyan materyalinin üzerine nazikçe ekleyin. Bu aşamada, transfect edilmiş jerk hat hücreleri enfektif HIV üretme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, HIV eksprese eden hücrelerle temas eden tüm pipet uçları %10'luk çamaşır suyu çözeltisi ileledezenfekte edilmelidir.

Biyogüvenlik kabini içindeki bir kaba atmadan önce, tüpün kapağını kapatın, tüpün dış kısmına %70 ethanol çözeltisi püskürtün ve kuru bir kim wipe ile silin; ardından hücreleri oda sıcaklığında, fren kapatılmış şekilde, 400 Gs hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, bir pipet kullanarak hücreleri besiyeri-pellet arayüzünden dikkatlice alın ve hücreleri yeni bir 15 milliliter konik tüpe aktarın. Hücreleri PMI medyumumuz ile toplam 15 milliliters hacme ulaşana kadar seyreltin ve 300 GS hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, peleti üç mililitre jerk hat kültür ortamında süspanse ederiz ve altı kuyucuklu bir plakanın iki santimetrelik kuyucuğuna aktarırız. Plakayı, ertesi gün kullanılmaya hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Aynı günün akşamında, hedef hücreler olarak kullanılan primer CD4 pozitif T hücrelerini donör hücrelerden ayırt edebilmek için etiketleyin. Öncelikle, altı primer CD4 pozitif T hücresinden 4x10⁶ tanesini 400 G'de 10 dakika santrifüj ederek peletleyin.

Ardından hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve yeniden süspande edin. İki mililitre PBS içinde süspande edin, nihai konsantrasyonu 1.5 micromolar olacak şekilde cell tracker orange ekleyin ve 37 °C'de dakikalarca inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonu tamamlandığında, sekiz mililitre tam chica medyumu ekleyin ve 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri, mililitre başına 10 ünite IL two ile desteklenmiş üç mililitre tam medyumsun içinde yeniden süspanse edin ve gece boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, donör ve hedef hücreler hücreden hücreye transfer deneyi için hazır hale gelir. Hücreden hücreye transfer deneyini kurmadan önce, platformu oda sıcaklığındaki dalgalanmalara karşı korumak için görüntüleme haznesini hazırlayın.

Oda arka plan ışığını engellemek için, tüm mikroskop ısı düzeneğinin üzerine büyük siyah bir örtü serilerek sistem çevresinde yalıtımlı bir hava cebi oluşturulur. Görüntüleme haznesi, sıcaklık geri bildirimi için numunenin yanına yerleştirilmiş T tipi bir termokupl ucu bulunan termostatik bir ısıtıcı kullanılarak stabil 37 °C'de tutulur. Numuneyi yerleştirmeden önce 30 dakika boyunca ön ısıtma yapın.

HIV'nin hücreden hücreye geçişinin 3B konfokal görüntülerini oluşturmak için ters optik mikroskopla dönen disk konfokal görüntüleme kullanılır. Z tablası dahil tüm donanım ve veri toplama işlemleri, and veya IQ versiyon 1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir; tarama işlemi, hızını desteklemek amacıyla tarama hızını ciddi şekilde artırmak için eş zamanlı olarak 800'den fazla konfokal nokta kullanan bir CS U 10 dönen disk konfokal ünitesi ile gerçekleştirilir. CS U 10, hem fotobağlamayı hem de fototoksisiteyi azaltan, düşük ışıkta hızlı görüntüleme sağlayan yüksek hassasiyetli bir elektron çarpanlı şarj coupled cihaz kamerası ile eşleştirilmiştir.

Floresan ışık kaynağı, çok dalga boylu bir argon kripton iyon gaz lazeridir. İstenen dalga boylarını seçmek için bir akustik optik ayarlanabilir filtre veya A OTF kullanılır; burada bu dalga boyları 488 nanometre ve 568 nanometredir. Ayrıca fotobleşmeyi daha da azaltmak ve görüntüleme süresini uzatmak için güç kontrolü sağlanır. A OTF, kamera görüntü almadığında, her 15 ila 30 milisaniyelik pozlamanın ardından lazeri hızla kapatarak, görüntüler E-M-C-C-D kamerasından bilgisayara aktarılırken gereksiz pozlamayı önler.

Lazer ışığı, 405, 488, 568 ve 647 nm dört bantlı dikroik ayna kullanılarak dönen disk sistemine entegre edilir; floresan emisyonu, bir görüntü ayırıcıyla birlikte 560 nanometrelik uzun geçiren dikroik ayna kullanılarak dalga boyuna göre ayrılır. Yeşil kanal 525/50 nanometrelik bant geçiren filtre ile, kırmızı kanal ise 609/54 nanometrelik bant geçiren filtre ile filtrelenir. İki kanal, E-M-C-C-D kamerasına yan yana yansıtılır.

Görüntüleme odası ısınırken, hücreden hücreye aktarım deneyi için hücreleri hazırlayın. HIV gag IGFP eksprese eden ette hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın. Virüs eksprese eden hücrelere doğrudan maruz kalmamak için hemositometreyi bir Petri kabına yerleştirin.

Hücreleri karbondioksitten bağımsız besiyeri ile yıkayın ve mililitre başına 1 ila 3 × 10⁷ hücre konsantrasyonunda canlı hücre görüntüleme besiyerinde yeniden süspande edin. Karbondioksitten bağımsız besiyeri kullanımı, karbondioksit ortam odasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Görüntüleme için.

Hücreleri sayın, yıkayın ve etiketlenmiş primer CD4 pozitif T hücrelerini, tıpkı Jurkat hücreleri için gösterildiği gibi yeniden süspande edin. Ardından, hücreden hücreye transferi başlatmak için 20 µL HIV gag IGFP transfekte edilmiş Jurkat hücresini 40 µL etiketlenmiş primer CD4 pozitif T hücresi ile karıştırın ve 50 µL'lik miktarı doku kültürü işlemine tabi tutulmuş, gaz geçirgen bir EBD mikro odasına yükleyin. Odayı tıpalarla kapatın ve tıpaları, tıpa-EBD odası arayüzünü parafilm ile sararak sabitleyin.

%70 etanol emdirilmiş bir kimyasal mendil ile görüntüleme haznesini silin ve çeker ocak altında kısa bir süre hava ile kurumasını bekleyin. Kazara maruz kalmayı önlemek için kapalı görüntüleme haznesini sızdırmaz bir kap içerisinde taşıyın. IBD görüntüleme haznesi hücrelerle yüklendikten hemen sonra taşıma sırasında hazne düşürülmediği sürece, cihazı mikroskoba monte edin.

Yüksek sayısal açıklığın, 3D görüntü yığınları başına elde etme hızını maksimize etmek için çözünürlüğü önemli ölçüde artırması nedeniyle, hücre çiftlerinin görüntülerini 60 x 1.42 NA yağ daldırma objektif kullanarak alın. EM CD kamerasının kayıt bölgesini bir hücre çiftinin hemen çevresine kadar kırpın. Ayrıca, bu koşullar altında 0,45 ve 0,75 mikrometre arasında büyük bir Z adımı da görüntüleme hızını artırmaya yardımcı olabilir.

Görüntüler 20 ila 60 dakikalık aralıklarla sürekli olarak kaydedilir. Aynı örnek noktasının tekrarlanan görüntülemesi, elde edilirken minimum fotobleaching ile altı saate kadar uzayabilir. Her bir veri segmenti, toplamda beş ila 20 gigabayt yer kaplayabilen on binlerce görüntüden oluşur.

Büyük dosyaların taşınmasını ve analizini kolaylaştırmak için, her dosya parçalara ayrılarak bir gigabyte'lık TIFF görüntü dosyası segmentleri olarak dışa aktarılır. Elde edilen görüntüleri analiz etmek için çeşitli görüntü analiz yazılım programlarından herhangi birini kullanın. Yoğunluk ağarma düzeltmesi ile gag puncta'larının otomatik ve manuel takibi dahil olmak üzere görüntü analizinin ayrıntıları için beraberindeki yazılı protokole başvurun.

Karıştırmadan sonraki 10 ila 15 dakika içerisinde, HIV gag IGFP eksprese eden jerk kedi hücrelerinin primer CD four pozitif T hücrelerine yapıştığı görüntülenerek gözlemlenebilir. Bu konjugatlar aracılığıyla, hem enfekte hücrelerdeki hem de hedef hücrelerdeki gag punktalarının hareketleri değerlendirilebilir. Sinaps oluşumundan sonra, 30 dakika ile üç saat arasında, gag IG FP punktalarının cell tracker ile işaretlenmiş hedef hücrelere doğru hareketi gözlemlenebilir.

T-hücreleri arasında HIV'nin hücreden hücreye transferini nasıl görselleştireceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürleri uygularken, HIV eksprese eden hücrelere maruz kalmış örneklerle çalışırken tüm biyogüvenlik seviyesi iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç önlemlerine uymayı hatırlamak çok önemlidir. Ayrıca, transfeksiyonu optimize etmek için iyi korunan JCA hücreleri ve endotoksin içermeyen DNA kullanmayı unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.