Bireysel Presinaptik Terminalleri Dopamin Yayın FFNs ile görüntülendi

Floresan yalancı nörotransmitter. FFN 511, beyin kesitlerine uygulandığında sinaptik fiziksel monoamin taşıyıcısı için bir substrat görevi görebilen floresan monoamindir. FN 511, monoamin taşıyıcısı aracılığıyla dopaminerjik sinaptik veziküller tarafından alınır ve S stratumundaki gibi monoaminerik nöronların presinaptik terminallerinden gerçekleşen transmitter salınımını doğrudan görselleştirmek için kullanılabilir. Terminallerden gerçekleşen transmitter salınımı, kesitte noktasal floresan sinyallerindeki azalma olarak görülür.

Bu videoda, FFN 511 ile boyanmış ve çok fotonlu lazer mikroskobu kullanılarak görüntülenmiş, 250 µm kalınlığında koronal sal dilimleri hazırlanmaktadır. iCal salınımının frekansa bağlı heterojenliğini ortaya çıkaran detaylandırma deneyleri gösterilmektedir. Merhaba, ben Columbia Üniversitesi Nöroloji Bölümü'ndeki David s Lab'dan HU.

Merhaba, ben de Soldier Lab'den Minerva. Bugün size, beyin kesitlerindeki dopamin terminallerinin floresan yalancı nörotransmitterler ile işaretlenmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda dopamin salınımını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Akut sal dilimleri hazırlamadan önce, yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) oksijenlendirilmeli ve beyin çıkarılmadan önce en az 15 dakika boyunca buzla soğutulmalıdır; A CSF'nin buz gibi soğuk ve oksijenle zenginleştirilmiş olduğundan emin olun. Diseksiyon sırasında, farenin tüm beynini çıkarın ve hızlı yapıştırıcı kullanarak vibram tepsisine sabitleyip vibram üzerine yerleştirin. Beynin çıkarılması ve sabitlenmesi işlemi iki dakika içinde tamamlanmalıdır.

Tepsiyi, +1,54 ile +0,623 arasında 250 µm kalınlığında kesilmiş koronal düzlemdeki veya beyin dilimlerindeki soğutulmuş oksijenli A CSF ile doldurun. İğne ile altı yarım dilime ayrılabilen üç tam dilim elde edilecektir. Beyin dilimleri inkübe edilirken, bunları oda sıcaklığında oksijenli A CSF içinde en az bir saat bekletin.

Oksijenlendirilmiş A CSF içerisinde, 10 millimolar FFN 511 stok çözeltisini A CSF'ye ekleyerek 10 micromolar FFN 511 yükleme çözeltisini hazırlayın. Ardından, A CSF içerisinde yüz micromolar A-D-V-A-S-E-P seven çözeltisini hazırlayın; her iki çözeltiyi de dilimlere ayrı ayrı yüklemeden önce en az 15 dakika boyunca oksijenlendirin. Her bir beyin dilimini, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca FFN 511 yükleme çözeltisi ile inkübe edin.

Ardından, yüklü kesiti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oksijenlendirilmiş 100 µM advers, seven A CSF içinde inkübe ederek hücre dışı dokuya bağlı di'yi uzaklaştırın; kesitler artık görüntülemeye hazırdır. FFN 511 boyaması, kesitlerde bir prairie Ultima Çok Fotonlu lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülenecektir. FFN 511 yüklü kesiti kayıt odasına yerleştirin ve dakikada 1-2 mL akış hızıyla oksijenlendirilmiş A CSF ile süperfüze edin. Ardından, hareketi minimize etmek için kesitin üzerine naylon telli bir platin harp yerleştirin.

Hareketi daha da en aza indirmek için, görüntüleme öncesinde kesitlerin oda içerisinde en az 10 dakika boyunca stabilize olmasını sağlayın. 10 x su daldırma objektifi altında parlak alan lüminesansı ile dorsal stri AUM'u görselleştirin ve konumlandırın; stimülasyon deneyi gerçekleştirmek için bipolar bükümlü tungsten elektrotları bu bölgeye yerleştirin. Boştaki görüntüleme alanı 300 mikrometre içerisinde yer almaktadır.

Uyarıcı bipolar elektrodun iki ucu arasına, FFN 511 ile işaretlenmiş Sal terminallerinin bulunduğu bölgeyi, 63 x su daldırmalı ultraviyole objektif altındaki görsel alan görüntüsünün merkezine yerleştirin. FFN 511, Spectral Physics marka mi tai lazer ile 760 nanometrede uyarılır. SAL terminallerinin optimal floresansı bir bant geçiren filtre aracılığıyla görülür; görüntüleri 12 bit formatında, 512 by 512 piksel çözünürlükte ve 75 by 75 mikrometre ilgi alanları ile yakalayın. FFN 511 ile işaretlenmiş Sal dopamin terminallerini içeren örnek bir görüntü burada gösterilmiştir.

FFN 511 etiketi, potasyum klorür amfetamin sülfatın yüksek konsantrasyonları ile veya potasyum klorür etiket giderme deneyinde elektriksel stimülasyon ile giderilebilir; beyin kesitine yüksek potasyumlu A CSF çözeltisi uygulandığında, FFN 511 etiketi dört dakika içinde giderilir. Elektriksel stimülasyonla FFN 511 boyamasında, zaman içindeki FFN 511 etiket gidermesini izlemek için XYZT görüntüleri kaydedin. Kesitin minimum düzeyde hareket ettiğinden ve kontrol görüntülerinin elde edilmesini takiben lazer tarafından fotobleyking oluşmadığından emin olmak için stimülasyondan önce Zack'in en az beş dakika boyunca kontrol zaman serisi görüntüsünü alın.

Bipolar elektrotlar kullanılarak, bir master eight pulse jeneratörü tarafından tetiklenen bir isof lex stimulus izolatörü aracılığıyla striatuma yerel olarak 1, 4 veya 20 hertz frekanslarında stimülasyon uygulanırken XYZT görüntülemeye devam edin. Bu video, bir sal beyin kesitinde ekzositoz sırasında FFN 511'in yayılımını göstermektedir. Hazırlık aşamasında, FFN 511'in SAL'a yüklemesi tamamlandığında; striatumda yoğun etiketleme, kortekste seyrek etiketleme ve korpus kallozumda ise hiç etiketleme görülmediği gözlemlenir.

Dopamin terminallerinin seçici etiketlenmesi, potasyum klorür öncesindeki ve 70 millimolar potasyum klorür uygulamasından iki dakika sonrasındaki bu temsili görüntülerde gösterildiği gibi, yüksek potasyum klorür ile ortadan kaldırılabilir. FFN 511 etiketlemesinin CSF kaybı amfetamin ile de gerçekleştirilebilir. Bu görüntü ise amfetamin öncesindeki striatumdaki FFN 511 etiketlemesini göstermektedir.

Bu görüntü striatumun 20 µM amphetamine ile detaining işleminden 20 dakika sonrasını gösterirken, lokal elektriksel stimülasyon ile FFN 511 etiketlemesinin detaining işlemi bu görüntülerde örneklendirilmiştir; bu görüntüler stimülasyon öncesindeki ve 4 Hz stimülasyon başlangıcından 217 saniye ve 514 saniye sonrasındaki striatumdaki FFN 511 etiketlemesini göstermektedir. Normalize edilmiş floresan yoğunluğunun zamana göre değişimini gösteren bu grafik, FFN 511 detaining işleminin kalsiyum ve frekans bağımlı olduğunu göstermektedir; içi boş üçgenlerle temsil edilen kontroller hiç stimülasyon almamıştır. İçi boş dairelerle temsil edilen kadmiyum klorür ile detaining işlemi, stimüle edilmemiş kontrollerle aynıydı.

Renkli dairelerle temsil edilen her stimülasyon frekansı için sönümleme eğrileri, tek bir eksponansiyel bozunma fonksiyonu ile fitlenmiş ve yarı ömür değerleri tau'nun 0.693'e bölünmesiyle hesaplanmıştır. Size, akut dilimdeki dopamin terminallerine floresan kuvvet nörotransmitteri FFN five 11'in nasıl yükleneceğini, bunun yüksek potasyum ile nasıl serbest bırakılacağını ve stimülasyonun nasıl uyandırılacağını göstermiş olduk. Bu, nörotransmitter salınımını tekil sinaptik terminaller düzeyinde optik olarak incelemek için geliştirilen ilk yöntemdir.

Bu prosedürü uygularken, kesitlerin oldukça sağlıklı tutulmasının önemli olduğunu hatırlamak gerekir; ayrıca yükleme süresi, arka plan ağartma ve hareket artefaktları konusunda dikkatli olunmalıdır; kesitler, hazırlıktan sonra dört saate kadar iyi FFN beş 11 yüklemesi ve görüntülemesi sergiler. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.