Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

Drosophila, kalp gelişimi, fonksiyonu ve temel pacemaker aktivitesinin incelenmesi açısından genetik olarak caziptir. Bu prosedür, hem sağlam hem de diseke edilmiş larva preparatlarının nasıl hazırlanacağını ve kalp hızının nasıl izleneceğini göstermektedir. Diseke edilmiş preparat, iyon kanalı fonksiyonlarına daha fazla erişmek için hücre dışı veya hücre içi potansiyel kayıtlarının alınmasına da olanak tanır.

Merhaba, ben Kentucky Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden öğretim üyesi Robin Cooper. Bugün öğrencilerim Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward ve Easter Boku, Drosophila larvalarında kalp hızını izlemek için kullanılan çeşitli prosedürleri size gösterecekler. Aşağıdaki kısıtlanmamış yönteme, larvaların tek bir odak düzleminde görüntülendiği için karınca çiftliği adı verilmektedir.

Larvaların en iyi şekilde görselleştirilmesi için, 1 cm x 0,5 cm'lik bir dikdörtgen alan üzerinde en iyi uzamsal çözünürlük ve büyütmeyi elde etmek amacıyla 2x taban objektifli ve 0,5x tüp objektifli bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Fotoğraflar ve videolar, oküler aparatına takılı bir kamera aracılığıyla kaydedilebilir. Bu yönteme başlamak için, bir larvayı ince bir yem tabakasıyla birlikte iki lam arasında sıkıştırın.

Lamlar, dört yanındaki plastik ara parçalarıyla 1 ila 1,5 milimetre mesafe ile tutulur. Larvanın başının aşağıya doğru bakmasını sağlamak için preparatı birkaç dakika boyunca 20 ile 45 derece arasında eğik tutun. Kalbin atışını izlemek için, kalbin veya iki trakeanın en iyi kontrastını sağlayacak şekilde mikroskop aynasını ayarlayın.

Yapıştırıcı yöntemi, larvaları bir lam üzerinde sabitlemek için kullanılan kalıcı bir mount yöntemidir. Yapıştırıcı yöntemine başlamak için, temiz bir lamel camı bir lamın üzerine yerleştirin. Lamel camının bir köşesine küçük bir damla hızlı yapıştırıcı sürün.

Ardından, larvaları suyla durulayın. Fazla yemi uzaklaştırmak için sıvıyı bir peçete veya kağıt havlu köşesiyle emdirin. Larva tamamen durulandıktan sonra, temiz bir pensle nazikçe alın ve mikroskop altında lam üzerine, örtü camından uzağa, karnı üzerine gelecek şekilde yerleştirin.

Midenin üzerinde ince siyah kıllarla birlikte seyrek yatay oluklar bulunacaktır. Larvaların sırtı yukarı bakmalıdır ve trakealar olan iki paralel şerit şeklinde belirgin hatlar içerir. Yalnızca yapıştırıcıyı tutmak için ayrılmış ikinci bir pens seti kullanarak, lamın ucundaki damladan küçük bir miktar alın ve bunu karşı taraftaki köşeye yerleştirin.

Cımbızın ucunu kapatmaya yetecek kadar küçük bir miktar kullanın. Hayvanı alın ve karnı siyah ağza bakacak şekilde yapıştırıcının üzerine yerleştirerek sabit kaldığından emin olun.

Kancalar, lamın kenarında veya kenarına yakın olmalı, ağız kancaları ve kahverengi spiral glüye temas etmemelidir. Larvayı düzleştirmek için üzerine hafifçe bastırın.

Bir test maddesi uygulamak için, bir şırınga yardımıyla larvaların başının yakınına küçük damlacıklar damlatmak en uygun yöntemdir. Spiral yapıların bir dakika içindeki atım sayısını sayarak kalp hızını gözlemleyin. Daha uzun süreli gözlemler için larvaları bulundukları yerde besleyebilir ve dehidrasyonu önlemek için nemlendirebilirsiniz; mikroskop altında kullanılabilir bir diseksiyon plakası hazırlamak için, bir manyetik bant parçasının merkezine skalpel ile iki santimetre çapında bir delik açın ve bunu bir lam üzerine yapıştırın.

Daha kolay iğneleme yapmak için, bükülüp ataçlara yapıştırılmış diseksiyon iğneleri kullanın. Diseksiyon sırasında, sağlam bir üçüncü instar larvayı diseksiyon plakasına yerleştirin. Sırt kısmı yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinde, trakealar kütikülden görünür olmalıdır.

Larvaların ağız kancalarının her iki yanına iki iğne ve spirallerin her iki yanına diğer iki iğneyi yerleştirin. Ardından, larvaları nemli tutmak için salin ekleyin. Daha sonra, kodle ucunun yanından yatay bir insizyon yapın ve bunu, hayvanın başına doğru spirallerin yanından devam eden boylamsal bir kesikle takip edin.

Bir dorsal pini kaldırın ve kütikülün altına geçirin. Yaymak için pini kullanın. Vücut boşluğunu açın.

Diğer üç iğne ile işlemi tekrarlayın. Hayvan iğnelenerek açıldıktan sonra, trakeaya veya kalbe zarar vermemeye dikkat ederek iç organları çıkarın. Beyin ve bazı yağ cisimcikleri dahil bazı yapılar kalbe bağlıdır ve çıkarıldıklarında kalbe zarar verebilirler.

Diseksiyondan sonra preparatın HL three salin banyosunda üç ila beş dakika boyunca dinlenmesine izin verin; hücre içi ve alan kayıtları, farmakolojik ajanlar doğrudan kalbe uygulanırken bu preparatta gerçekleştirilir. Bu disseksiyon adımının toplam süresi üç ila altı dakikadır. Elektriksel stimülasyon (pacing) gerçekleştirmek için öncelikle fokal elektrotlar hazırlanmalıdır; fokal bir elektrot oluşturmak için cam bir elektrodu, uç kısmını ateşle parlatmak (fire polish) amacıyla bir ısıtıcı eleman üzerinden geçirin ve yaklaşık 45 derecelik kademeli bir büküm yapın, ardından oda sıcaklığındaki HL three salin ile doldurulmuş fokal elektrodu, ucu aşağı bakacak şekilde manipülatöre monte edin.

Stimülatör telinin elektrot içindeki saline temas ettiğinden ve stimülatörün kapalı olduğundan emin olun. Mikroskop üzerine yeni bir kalp diseksiyon preparatı sabitleyin. Topraklama telini saline yerleştirin.

Pinlere dokunmamaya veya preparasyonu bozmamaya dikkat edin. Manipülatörü kullanarak elektrodu salin çözeltisinin içine indirirken odağınızı elektrot üzerinde tutun. Salin çözeltisinin içine girdikten sonra, elektrot ucunu lümeni kalbe düz olacak şekilde konumlandırın ve kalbe hafifçe temas ettirin.

Elektrot yerleştirildikten sonra, stimülatör frekansını iki hertz'e, voltajı ise en düşük ayara getirin. Stimülatörü açın. Frekansı yaklaşık üç hertz'e ayarlayın ve kalp atışı hızı stimülatörün ritmiyle eşleşene kadar voltajı yavaşça artırın.

Ritim artık stimülatör aracılığıyla manipüle edilebilir. Kontraksiyonu veya elektriksel iletiyi etkileyip etkilemediklerini görmek için bileşikler eklenebilir. Alan potansiyeli kayıtları gerçekleştirmek için, bir makro patch kayıt elektrodunu banyo ortamıyla doldurun ve bunu bileşik bir mikroskop üzerindeki bir manipülatöre monte edin.

Elektrodu bir amplifikatöre ve kayıt düzeneğine bağlayın. Mikroskoba sabitlenmiş bir diseksiyon preparatının kalbi üzerine, elektrodun lümenini indirmek için manipülatörü kullanın. Elektrot ucuyla kalbe çok hafifçe dokunun.

Kalbin başka bir bölgesinden alan potansiyellerini kaydetmek için artık alan kayıtları yapılabilir. Elektrot ucunu nazikçe kaldırın ve manipülatör ile yeni bir bölgeye taşıyın, ardından uç alan potansiyeli kayıtlarını tekrarlayın. Larval miyositlerin transmembran potansiyellerini ölçmek için kalpteki elektriksel sinyallerin hızının ve süresinin hassas şekilde izlenmesine izin verin.

Öncelikle, üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş keskin bir elektrodun lümeninin, dikeyden yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kalbe karşı düz olduğundan emin olun. Doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, elektrodun ucuyla kalbe nazikçe dokunun ve ucu bir hücreye doğru hafifçe vurun. Elektrot kırılmamışsa tekrar kullanılabilir.

Hücre içi kayıtlar, aksiyon potansiyelinin iyonik temelini ve potansiyellerin karakteristik şekillerini ölçerek iyon kanalı mutasyonlarının veya kanal modülatörlerinin etkilerini incelemeye olanak tanır. Böylece size kalp kayıtlarının nasıl yapılacağını, ayrıca hücre içi ve alan potansiyellerinin nasıl alınacağını göstermiş olduk. Bu teknikleri, farmakolojik manipülasyonların ve gen değişikliklerinin yanı sıra kalp değişimlerini incelemek için kullanabilirsiniz.

Bu prosedür uygulanırken, kalbe bağlı olan ilgili bir yapının çekilmemesi ve odak elektrodu ile çok sert bastırılmaması önemlidir. Ayrıca yapıştırma yönteminde, ağzın veya kürenin yapışarak kapanmamasına dikkat edin. İşlem bu şekildedir.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.