Dayak Kalp görselleştirme Drosophila

Erişkin kalbin diseksiyonu için Drosophila'da atan bir kalbin görüntülenmesine yönelik iki teknik burada sunulacaktır. İlk olarak, baş ve toraks belirtilen hat boyunca tek bir kesiyle çıkarılır. Ardından, genitalyalar uzaklaştırılır ve abdominal vücut boşluğu pensle açılır; bağırsak ve dişi sinek durumunda yumurtalıklar çıkarılır.

Larva kalbinin sabitlenmesi için erişkin kalbi açığa çıkarmak amacıyla, üçüncü ve dördüncü abdominal segmentlerdeki abdominal yağ cismi dikkatlice aspire edilir. Tampon çözelti içine yerleştirilen tek bir larva, önce larva baş bölgesi çevresine histo acral yapıştırıcı uygulanarak sabitlenir. Larva nazikçe gerilir ve ardından posterior uca ve larva vücut duvarının yan kısımlarına daha fazla yapıştırıcı uygulanır.

Merhaba, ben GI Fler. Merhaba, ben Karen er. İkimiz de Burnham Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ndeki Gelişim ve Yaşlanma programının üyeleriyiz.

Bugün size, larva ve yetişkin drosophila'nın atan kalbini görüntülemek için geliştirdiğimiz prosedürleri göstereceğiz. Bu iki hazırlık yöntemini de meyve sineğinin kalp atış parametrelerini görüntülemek, incelemek ve nicelleştirmek için bir yol olarak kullanıyoruz. Başlamadan önce, ilk olarak yapay bir hemolenf çözeltisi hazırlıyoruz.

Bu çözelti, kullanımdan hemen önce soğutulmuş stok çözeltilerden yapay hemolenfe eklenmesi gereken sükroz girişi, helo içerir. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yapay hemolenfi oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika boyunca hava kabarcıklarıyla oksijenlendirin. Ardından, sinekteki yağ cisimciklerinin uzaklaştırılması için gerekli olacak birkaç ince kılcal boruyu standart bir pipet çekici kullanarak hazırlayın.

Her şey hazırlandıktan sonra, yetişkin sinekler anestezi altına alınmalıdır. Bu işlem, sineklerin iki ila beş dakika boyunca kısa süreli olarak fly nap'a maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilebilir; ancak sineklerin fly nap içinde beş dakikadan fazla tutulmamasına dikkat edilmelidir. Sinekleri anestezi altına almak için kısa süreli soğuğa maruz bırakma yöntemi de kullanılabilir, ancak kalp atış hızı ve hareketlilik üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için karbondioksit önerilmemektedir.

Ardından, anestezi uygulanmış sinekler sırtları aşağıya gelecek şekilde, ince bir vazelin tabakasıyla kaplanmış bir Petri kabına yerleştirilir. Kanatlardaki ve gövdedeki hidrofobik kütikül jelatine tersine çevrilebilir şekilde yapışmalıdır, ancak gerekirse sineğin konumu yeniden ayarlanabilir. Kavisli bir yaylı makas kullanılarak ilk kesi yapılır.

Bu işlem, makas uçlarının sineğin bacaklarının altına yerleştirilmesi ve boyun yakınındaki dorsal yüzeye doğru açılı bir şekilde indirilmesiyle gerçekleştirilir. Kesim yapıldığında, baş ventral sinir kordonu ve bacaklar tek bir hamleyle çıkarılır. Ardından preparat, yaylı makas kullanılarak oksijenlendirilmiş yapay hemolenf çözeltisine daldırılır.

Karın segmenti yedi ve sekizden oluşan abdomenin arka ucu, tek bir kesik ile çıkarılır. Bu işlem, abdomenin her iki kenarı boyunca lateral kesiler yapılmasına olanak sağlar ve arka bağırsak ile abdominal kütikül arasındaki bağlantının koparılmasına hizmet eder. Makas uçlarını abdomen ucundaki küçük açıklığa yerleştirin ve kütikülü lateral olarak kesin.

Bu işlem, ventral kütikülün bir kenarını serbest bırakır. Serbest kalan parçayı pensetle tutun ve abdomenin karşı lateral kenarı boyunca benzer bir kesi yapın. Serbest kalan ventral abdominal kütikül parçası artık çıkarılabilir.

Bağırsak ve diğer abdominal organlar genellikle mücevher pensi kullanılarak ve hafifçe çekilerek tek bir kütle halinde çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, küçük hava kaslarıyla dorsal kütiküle hâlâ bağlı olan ve yağ gövdeleriyle çevrili olan atan kalp tüpünü ortaya çıkarır. Çekilen kapilerler, vakum kaynağına bağlı 1/16 inçlik plastik bir tüpe yerleştirilir.

Emme kuvveti uç çapıyla orantılıdır, bu nedenle kurulum yapıldıktan sonra çapı 40 mikrondan büyük uçlara sahip pipetler kullanılmamalıdır. Bu emme sistemi, kalp tüpünün etrafındaki fazla yağı çekmek için kullanılır. Ayrıca kütikula çevresinde biriken hava kabarcıklarını ve herhangi bir kalıntıyı temizlemek için de kullanılabilir.

Kalbe doğrudan dokunmaktan kaçınmak için azami dikkat gösterilmeli ve kalbin posterior kısmı çok kırılgan olduğu için bu bölgeden de uzak durulmalıdır. Yetişkin drosophila kalp tüpü şu an açığa çıkmış durumdadır ve gerekirse atıyor olmalıdır. Kütikül ve ona bağlı kalp, kütikül petroleum jelyinden nazikçe kaldırılarak ve ardından dikkatlice tekrar bastırılarak yeniden konumlandırılabilir.

Kalp dokusuyla herhangi bir temastan kaçının. Bu aşamada, preparatın içinde bulunduğu çözelti taze yapay hemolenf ile değiştirilmelidir. Herhangi bir manipülasyon öncesinde, bu preparatın oksijenleme ile 20 ila 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verilmelidir.

Hazırlığın 60 dakikadan daha uzun süre korunması gerekiyorsa, taze yapay hemolenf ile yeniden perfüze edilmelidir. Bu hazırlık artık optik kayıt için kullanılmaya hazırdır; ayrıca elektrofizyolojik kayıt veya histolojik manipülasyonlar için de kullanılabilir. Larva içinde atan kalbin görüntülenmesi için farklı bir teknik gereklidir.

Öncelikle, prosedürden bir gün önce lamel hazırlayın. Bu işlem, bir kürdan kullanarak yaklaşık 50 ila 70 µL Sylgard çözeltisinin 22 x 22 mm'lik bir lamel üzerine aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Sylgard'ın 65 °C'de gece boyunca sertleşmesini bekleyin.

Ardından, Brody ve Bates tamponu hazırlayın; hazırlandıktan sonra alikotlar -20 °C'de saklanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda çözülebilir. Son olarak, histo acral glü uygulamak için gerekli araçları hazırlayın. İlk olarak, birkaç ince kılcal boru çekin.

Ardından, 1,5 mililitrelik bir pipet ucunu çapı yaklaşık 1/32 inç olan küçük bir plastik tübe bağlayın. Küçük ucunu tübe yerleştirerek, geniş ağzı diğer uca gelecek şekilde bir kapiler yerleştirin. Kurulum tamamlandığında, kapileri bir damla glua batırıp plastik uca doğru hafifçe vakum uygulayarak kapileri histo glue ile doldurun.

Yapıştırıcı ile çalışırken, yapıştırıcı kapilerinin ucundaki fazla yapıştırıcıyı temizlemek için el altında ikinci bir cam kapiler bulundurulmalıdır. Yapıştırıcı, tamponlu salinle temas edene kadar sıvı halde kalır ve temas sonrası birkaç saniye içinde sertleşir. Bununla birlikte, yapıştırıcı genellikle kapiler ucundan temizlenecek veya numuneye uygulanacak kadar uzun süre plastik formda kalır.

Larvaların immobilizasyonuna başlamak için, syl guard'ın her köşesine yakın bir noktaya bir damla histo acral yapıştırıcı damlatın. Lamel üzerine, yapıştırıcı damlaların üzerine 50 µL B ve B tamponu ekleyin; bu işlem yapıştırıcının anında sertleşmesini sağlayacaktır, ardından yapıştırılan noktalar arasındaki boşluğu B ve B ile doldurun. Yapıştırıcı, tamponun lam üzerinde kalmasını sağlayacaktır.

Gezinme aşamasındaki bir L3 larvası alın ve hareketini yavaşlatmak için iki dakika boyunca buz üzerinde ıslak bir doku kağıdı parçasına yerleştirin. Ardından, larvayı tampon çözeltiye aktarın ve sırt kısmı yukarı gelecek şekilde konumlandırın.

Burası, larvaların özdeş kuşaklarının bulunmadığı taraftır. Baş bölgesi ile eşik koruyucusu arasına hızlıca biraz yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcı çok hızlı sertleşecek ve larvaların başının hareket etmesini önleyecektir.

Pens kullanarak hayvanı posterior spiraküllerinden dikkatlice tutun ve nazikçe gerin. Larvaların arka yarısının her iki yanına yapıştırıcı uygulayarak larvaları bu pozisyonda sabitleyin. Vücut duvarı kaslarının kütikülü daha fazla hareket ettirmesini önlemek için hayvanın yan taraflarına daha fazla yapıştırıcı ekleyin.

Larva şu an bu konumda sabitlenmiştir. Lam, yapay hemolenf veya PBS ile doldurulmuş küçük bir Petri kabına yerleştirilebilir; böylece kalp atımları, vücut duvarı hareketlerinden etkilenmeden kaydedilebilir. Yarı-intakt yetişkin drosophila kalbi, diseksiyondan sonra taze oksijenlendirilmiş yapay hemolenf içinde tutulduğunda saatlerce ritmik olarak atmaya devam edecektir.

Temsili bir örnek burada ve birinci ek videoda gösterilmiştir; burada gösterilen üçüncü evre larva kalpleri ve çıkıştan sonra bir ila üç haftalık genç sinekler genellikle 1 ila 3 Hz arasındaki hızlarda düzenli bir kalp atışı sergiler; üç haftadan daha yaşlı sinekler ise genellikle daha aritmiğendir. Buna rağmen, bu kalpler oksijenlendirilmiş yapay hemolenf içerisinde saatlerce spontane olarak atmaya devam edebilir. Diseksiyon prosedürü sonucunda hasar gören yetişkin sinek kalpleri, tipik olarak gevşeyemeyen ve genellikle kontrolsüzce atan aşırı daralmış lokal bölgeler gösterir. Üç haftalıktan küçük sineklerde 1 Hz'den daha yavaş kalp atış hızları nadiren gözlemlenir.

Sonuç olarak, bu tür preparatlar hasarlı kabul edilir ve atılır. Optik görüntüleme için larva ve yetişkin meyve sineği kalplerinin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Yarı-intakt preparat hazırlarken kalbe asla dokunmamanız gerektiğini unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.