Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Klinik proteomik, hastalıkların erken teşhisi ve prognozu için yararlı olacak biyobelirteçlerin keşfini vaat eden önemli ve yeni bir disiplindir. Burada; protein ekstraksiyonu, yeniden çözündürme, redüksiyon, alkilleme ve enzimatik sindirim dahil olmak üzere klinik proteomikte kullanılan çeşitli işlem adımlarını entegre eden yeni bir dijital mikroakışkanlar veya DMF yöntemini sunuyoruz. DMF, bir elektrot dizisi üzerinde örnek proteinlerin ayrı mikro damlacıklarını kullanır ve oda sıcaklığında çalıştırılabilir, bu da örneklerin paralel otomatik analizine olanak tanır.

Bu metodoloji, geleneksel yöntemlere göre önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir ve klinik proteomikte faydalı yeni bir araç olma potansiyeline sahiptir. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Kimya Bölümü ile Biyomalzemeler ve Biyomedikal Mühendisliği Enstitüsü'nde Profesör Erin Wheeler'ın laboratuvarından Steve Sche. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi'ndeki Wheeler Laboratuvarı'ndan Gabriel.

Ben de Toronto Üniversitesi'ndeki Wearer laboratuvarından Vivian Luke. Ben Erin Wheeler. Steve Mace ve Vivian ile birlikte çalışma şansına sahibim.

Bugün size dijital mikroakışkanlar kullanılarak gerçekleştirilen proteomik işlem prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda proteinleri ve biyolojik örnekleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Cam substratları Piranha çözeltisi ile temizleyerek işlemi çeker ocakta başlatın. Yeterli koruyucu ekipman kullanırken, piranha çözeltisinin üç birim konsantre sülfürik asit ve bir birim %30 hidrojen peroksitten oluştuğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu çözeltiyle çalışırken dikkatli olunmalıdır.

Cam altlıkları 10 dakika boyunca piranha çözeltisinde inkübe edin ve temizleme işleminden sonra, bunları deiyonize su ile durulayıp azot gazı ile kurutun. Krom kaplama ile 250 nanometre kalınlığa ulaşmak için altlıkları elektron demeti buharlaştırma odasına yerleştirin. Bu kalınlığa ulaşıldığında altlıkları odadan çıkarın, izopropanol ile durulayın ve ardından bir sıcak plaka üzerinde 115 degrees Celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca kurutun.

Kurutulmuş substratları 30 saniye boyunca spin kaplama yaparak hekzametilksilazin veya HMDS ile hazırlayın. Shipley S 1811 fotoğraf direnci ile aynı parametreleri kullanarak 3000 RPM hızında tekrar spin kaplama yapın.

Substratı doğrudan bir sıcak plaka üzerinde 100 °C'de ön ısıtmaya tabi tutun. Ardından, bir fotomaske aracılığıyla beş saniye boyunca ultraviyole veya UV ışınlamaya maruz bırakarak fotoresist desenlemesini gerçekleştirin. Sonrasında, UV ışınlamasına maruz kalmış substratları, substratı tamamen örtecek kadar Shipley MF 3 21 geliştiricide üç dakika boyunca bekleterek geliştirin.

Substratı DI su ile durulayın. Bir sıcak plaka üzerinde doğrudan 100 °C'de bir dakika boyunca pişirin. Substratları, onları tamamen kaplayacak kadar krom aşındırma çözeltisine 30 saniye daldırarak açığa çıkmış kromu aşındırın.

Substratları DI su ile durulayın ve kalan fotoresist tabakasını uzaklaştırmak için substratı tamamen kapatacak kadar Z 300 T sökücü içerisine 10 dakika boyunca daldırın. DI su ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurutun.

Bu kaplamanın ardından, kimyasal buhar biriktirme yoluyla substrat üzerine iki ila beş mikrometre kalınlığında yalıtkan bir polimer olan Paraline C biriktirilir. Yüzeyi hidrofobik hale getirmek için, %1 ağırlıkça floronert FC 40 çözeltisi substrat üzerine 2000 RPM hızında 60 saniye boyunca spin kaplama yöntemiyle uygulanarak 50 nanometre Teflon AF biriktirilir.

Üst plaka direğini oluşturmak için işlemi kaplanmamış indiyum kalay oksit veya ITO cam altlık ile tekrarlayın. Dijital mikroakışkan cihazı kurmak için her iki altlığı bir sıcak plaka üzerinde 160 °C'de 10 dakika boyunca pişirin.

Alt tabanın kontak pedlerindeki polimer kaplamaları bir bistüri ile kazıyarak temizleyin. Alt tabanın açığa çıkan pedlerini 40 pinli konnektörlerle bağlayın ve LabVIEW çalıştıran bir bilgisayarı açın. Sinyalleri dpad tarafından kontrol edilen rölelerin bulunduğu, kendi imkanlarımızla oluşturduğumuz bir kontrol kutusu kullanıyoruz.

Bilgisayar kontrol kutusu, 40 pinli konnektörler aracılığıyla cihaza 18 kilohertz sinyaller başına 100 volt RMS uygulanmasının kullanıcı tarafından kontrol edilmesini sağlar. Ayrıca bir fonksiyon jeneratörü ve amplifikatörü çalıştırın. Alt tabakanın kenarlarına toplam kalınlığı 140 mikrometer olan iki parça çift taraflı bant yerleştirerek cihazı monte edin.

Bir rezervuara 4 µL DI su pipetleyin ve desenlenmemiş indiyum kalay oksit lamı, Teflon kaplı tarafı aşağıya bakacak şekilde cihazın üzerine yerleştirerek cihazı kapatın. Üst plakaya bir toprak konnektörü bağlayın. Geri besleme kontrolünü kalibre etmek için LabVIEW'da oluşturulan başlatma programını çalıştırın; cihaz artık deneyler için hazırdır.

Bu protokolde, dijital mikroakışkanlar tasarımımızı ve kullanımını göstermek için protein örneği olarak sığır serum albümini veya BSA kullanacağız. BSA, 0,08% (w/v) onic F1 27 içeren 100 milimolar tris HCL pH 7,8'den oluşan çalışma tamponu veya WB içinde seyreltilir. Her bir örnek ve reaktif çözeltisinden bir mililitre hazırlayın ve bunların ekleneceği rezervuarı belirtin.

Reaktif hazırlığının ardından, cihazın üst plakasını çıkarın ve belirlenen hazneye dört µL çözelti pipetleyin. Hazneleri doldurduktan sonra, üst plakayı tekrar cihazın üzerine yerleştirin. Aşağıdaki adımları uygulamak için kurum içi lab view programını kullanın.

Unutmayın, bilgisayar arayüzü kullanıcının rezervuarlardan yaklaşık 600 nanolitre hacminde damlacıklar aktarmasına ve bu damlacıkları elektrot dizisi üzerinde manipüle etmesine olanak tanır. İlk olarak, R birinden protein içeren örnekten bir damlacık ve R ikisinden bir çöktürücü damlacık aktarın. İki damlacığı birleştirin ve proteinlerin yüzeye çökmesi için birleşik damlacığı beş dakika boyunca inkübe edin.

Süpernatantı çökmüş proteinden uzaklaştırarak atık rezervuarına aktarın. Çökmüş proteini yıkamak için, R dört'ten üç damla yıkama tamponu boşaltın ve bunları çökmüş proteinin üzerinden geçirerek atık rezervuarına yönlendirin. Çökeltinin kurumasına izin verin ve R beş'ten bir damla yeniden çözündürme tamponu proteinin üzerine boşaltın.

Çökelti çözülene kadar tamponu 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, R altısından bir damla indirgeyici ajan damlatın ve bunu numune damlasıyla birleştirin. Birleşmiş damlacığı, altı elektrot üzerinde dairesel bir düzende hareket ettirerek karıştırın.

Damlacığın oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilmesini sağlayın. R yedisinden bir damla alkilleyici ajan ekleyin ve bunu örnek damlacığıyla birleştirip karıştırın. Damlacığın, ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edilmesini sağlayın.

Son olarak, R sekizden bir damla tripsin dispense edin ve bunu örnek damlasıyla birleştirip ardından karıştırın. Damlanın, bir ısıtıcı plaka üzerindeki Petri kabında 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edilmesini sağlayın. Reaksiyonu sonlandırmak için üst plakayı çıkarın ve pipetleme yaparak sindirimi durdurun.

Reaksiyon damlacığının üzerine suda çözünmüş %2,5 trikloroasetik asitten altı mikrolitre ekleyin. Sönümlenmiş reaksiyon ürününü, örnek damlacığını doğrudan alt plakadan sifonlayarak saflaştırın. Üretici talimatlarına uygun olarak bir C 18 zip tip kullanarak, örnekler artık gerektiği şekilde seyreltilebilir ve bu sistemle örnekteki proteinleri tanımlamak için kütle spektrometrisi ile değerlendirilebilir.

Kütle spektrometrisini takiben proteinler, %99,9'luk güven aralığına eşdeğer olan 1 × 10⁻³'ten düşük olasılık skorları ve en az %30'luk dizi kapsama oranları ile tanımlanmıştır. Bu nedenle DMF, otomatik proteomik örnek işleme için oldukça kullanışlı bir metodolojidir. Böylece bugün, proteinleri otomatik bir şekilde ekstrakte etmek ve işlemek için dijital mikroakışkanları nasıl kullandığımızı göstermiş olduk. Bu metodoloji, protein izolasyonu ve tanımlanması sırasında meydana gelen örnek kaybı ve kontaminasyonu için potansiyel bir çözüm sunmaktadır.

Bu yöntemi gelecekte, immünolojik analizler ve hücre tabanlı analizler de dahil olmak üzere diğer biyolojik uygulamalarda kullanmayı umuyoruz. Bu tür bir deney yaparken en önemli şey, keyif almayı hatırlamaktır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.