Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Bu prosedürün genel amacı, bir saflaştırma adımı gerektirmeyen ve böylece herhangi bir protein kütüphanesiyle uyumlu olan modüler bir protein dizisi oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle assembly PCR aracılığıyla sentetik genlerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sentetik genler epoksi lamlar üzerine dizilir.

Mikroakışkan cihazı üretmek için silikon kontrol ve akış kalıpları ile PDMS kullanın. Ardından, mikroakışkan cihazı noktalanmış DNA dizisiyle hizalayın. Son olarak, tavşan retikülosit lizatı mikroakışkan cihaza akıtılır ve proteinler eksprese edilir.

Nihayetinde, floresan antikor işaretlemesi aracılığıyla binlerce proteinin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Mikroakışkan tabanlı tekniğin, protein mikro dizileri gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. DNA'yı mikro diziye yerleştiriyoruz ve ardından cihaz üzerinde proteinler üretmek için cellis kullanıyoruz.

Böylece protein saflaştırmaya gerek kalmaz ve proteinler asla kurumaz. Deney boyunca taze kalırlar. Mikroakışkan teknik aynı zamanda daha yüksek hassasiyet sağlar. Mikroakışkan cihazı oluşturmak için, elastomer salınımını kolaylaştırmak amacıyla silikon kontrol ve akış kalıplarını 10 dakika boyunca klorotrimetilsilan buharına maruz bırakın.

Pişirme adımlarının ardından, kontrol ve akış kalıpları için sırasıyla beş birim elastomer ve bir birim kürleme ajanı ile 20 birim elastomer ve bir birim kürleme ajanı oranlarında silikon bazlı elastomer ve kürleme ajanı karışımları hazırlayın. Beş birime bir oranındaki PDMS'yi kontrol katmanının üzerine dökün. Kontrol katmanındaki gazları vakumla uzaklaştırın ve 80 °C'de 30 dakika boyunca pişirin.

Ardından, 20:1 oranındaki PDMS karışımını akış katmanına 2.600 RPM'de 60 saniye boyunca spin coat ile kaplayın ve ardından 80 °C'de 30 dakika boyunca fırınlayın. SU-8 desenini soy Mamaya dikkat ederek, kontrol katmanını kalıptan yavaşça ayırın. Sonrasında bir bistüri kullanarak cihazı çevresinden kesin ve mikroskop altında kontrol kanallarına erişmek için küt uçlu bir iğne ile delikler açın.

Kontrol katmanındaki buton valfi reaksiyon odasının ortasına gelecek şekilde, sol üst köşeden başlayarak akış ve kontrol katmanlarını manuel olarak hizalayın. Ardından ilk sırayı hizalayın ve kontrol katmanını sıra sıra nazikçe bırakın. Tüm buton valflerin reaksiyon odalarının ortasında olduğundan ve adres ile giriş valflerinin akış kanallarıyla doğru konumda kesiştiğinden emin olun.

Tüm satırlar hizalanana kadar işlemi yerel olarak tekrarlayın. Tam olarak hizalandığında, PDMS'yi kenarlarından ve köşelerinden dikkatlice kaldırarak üzerindeki gerginliği giderin. Ardından, cihazı 80 °C'de iki saat boyunca pişirin.

Cihaz için DNA konstrüktları oluşturmak amacıyla akış kanallarına erişmek için, çevreyi kesin ve iki katmanlı cihazı akış kalıbı deliklerinden soyun. Bir T7 promotörü, bir ribozom bağlanma bölgesi, her iki ucunda farklı epitop etiketleri bulunan bir açık okuma çerçevesi ve bir T7 terminatöründen oluşan sentetik genler üretmek için PCR gerçekleştirin. Sentetik genleri dizilemeye hazırlamak için polietilen glikol ve D-triyoz dihidrat karışımı hazırlayın. Her reaksiyon için 384'lü kuyucuklara iki µL dağıtın.

Kuyu plakası. Sentetik genleri 384 kuyucuklu bir plakaya ekleyin. Ardından, nihai hacim 20 µL olana kadar distile su ekleyin.

Ardından, bir mikroarray spotlama yöntemiyle, epoksi kaplı cam altlıklara bir dizi sentetik gen yerleştirin. Bir stereoskop altında, mikroakışkan cihazı, DNA spotu DNA odacıklarının ortasına gelecek şekilde gen dizisiyle manuel olarak hizalayın. Daha sonra diğer sıraları da hizalayın.

PDMS üzerindeki herhangi bir gerilimi gidermek ve mikro dizeye iyi bağlandığından emin olmak için tüm cihazın ince ayarıyla işlemi tamamlayın. Yerel olarak kaldırın. Son olarak, cihazı bir sıcak plaka üzerinde 80 °C'de gece boyunca inkübe ederek cam lamela bağlayın.

Bu bölümde görselleştirme amaçlı gıda boyaları kullanılmıştır. Kontrol katmanındaki valfler, LabVIEW kullanılarak bilgisayar üzerinden çalıştırılmaktadır. LabVIEW betiği, elektronik bir kontrol kutusu aracılığıyla bir dizi solenoid mikro valfi kontrol eder.

Solenoid valf manifoldu, cihaz üzerindeki kontrol valflerine giden hava akışını ve basıncı kontrol eden basınçlı havaya bağlıdır. 0.02 inç iç çaplı esnek plastik boru ve paslanmaz çelik bir pin kullanarak cihazı solenoid valf manifolduna bağlayın. Boruları çift distile su ile doldurun ve pini kontrol katmanının erişim deliklerine yerleştirin.

Her bir tüpün ilgili kontrol kanalına bağlı olduğundan emin olun. Kontrol kanallarını aktifleştirmek için lab view uygulamasını çalıştırın, hava basıncını beş PS.I olarak ayarlayın ve ardından lab view betiği üzerinden valfi aktifleştirerek hava basıncı uygulayın. Bu işlem, kusurlu cihazların kontrol kanalları arasındaki potansiyel çapraz etkileşimi (crosstalk) belirlemek için PDMS kontrol kanallarına su itecektir.

Önce sandviç ve adres valflerini doldurun. Tüm kontrol kanalları ve valfler suyla dolduktan sonra, altlarındaki akış kanallarını kapatmak için valfleri hazırlayın. Bunu, önce hava basıncını 15 PSI değerine yükselterek, ardından LabView programı üzerinden bireysel solenoid valflere bağlı bir dizi açma-kapama anahtarı aracılığıyla gerçekleştirin.

Tüm vanaların açık olduğundan emin olmak için tüm anahtar düğmelerini açarak tüm vanaları aktifleştirin. Bir tüpü akış girişlerinden birine bağlayın ve cihaza 4 ila 5 PSI değerinde hava akışı sağlayın. Bu işlem, cam lam üzerindeki yapışkan vanaların serbest kalmasını sağlayacaktır.

Cihaz şu anda hazırlanmış ve görselleştirme amaçlı kullanıma hazırdır. Bu bölümde reaktifleri görselleştirmek için sarı gıda boyası kullanılmıştır ve renksiz çözelti; yüzeyde bir protein diziliminin kendi kendine montajını kolaylaştırmak ve mikroakışkan cihaz içinde spesifik olmayan emilimi önlemek amacıyla hippies'leri temsil etmektedir. Yüzeyi kimyasal olarak modifiye etmek için, önce gerekli çözeltiyi içeren yeni bir tüpü cihazdaki akış kanallarından birine bağlayın. Ardından tüpün boşta kalan ucunu manuel manifolda bağlayın ve hava basıncı akışını açın.

Yeni bir tüpe 40 µL biyotinle ilişkilendirilmiş BSA yükleyin ve bunun yaklaşık yarısını 20 dakika boyunca cihazdan geçirin. Her bir adım arasında, reaktif olmayan substratı uzaklaştırmak için 50 mM HEPES kullanın. Ardından, 25 µL streptavidini 20 dakika boyunca akıtın.

Biyotinize BSA'nın üzerine, buton çevresindeki yüzeyi aktive etmek için beş dakika boyunca HEPES ile yıkayın, buton valfini kapatın ve biyotinize BSA'nın geri kalanını akıtın, ardından tekrar beş dakika boyunca HEPES ile yıkayın. Son olarak, butonun altında bir anti-his tag dizisi oluşturmak için buton valfini açın ve cihaz üzerinde bir protein dizisi oluşturmak amacıyla 20 dakika boyunca 30 µL Penta-his biyotin akıtın. Boyun valflerini açın ve tavşan retikülosit akıtın.

Hızlı kenetli transkripsiyon ve translasyon reaksiyon çözeltisini cihaz aracılığıyla DNA odasına aktarın. Ardından, her bir geni kendi ortamından ayırmak için sandviç valfleri kapatın ve cihazı bir sıcak plakada 30 °C'de 2,5 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, proteinlerin uç terminalini C mix SI 3 antikoru ile işaretleyin.

Son olarak, 532 nanometre lazerli ve 575 nanometre emisyon filtreli bir mikroarray tarayıcı kullanarak protein seviyelerini belirleyin. Bu şekil, bir protein dizilimindeki farklı protein ekspresyon seviyelerini göstermektedir.

Genellikle bir gen kütüphanesinin %20'si tespit edilebilir düzeylerde ekspres edilemez. Arka plan düzeyleri, üzerine DNA damlatılmamış odacıklar kullanılarak belirlenmiştir. Bu nedenle, ilgili protein odacıklarından gelen sinyaller ya gürültüden ya da işaretleme antikorlarının spesifik olmayan absorbsiyonundan kaynaklanmaktadır.

Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, bu cihaz doğrulaması dört saat ve çip deneyi beş saat sürer.