İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Ribo nükleer proteinlerin pre-mRNA'lar üzerindeki bağlanma bölgelerini haritalamak için, ilgili pre-mRNA'nın belirlenmiş bölgesini 30 nükleotitlik pencereler halinde döşeyerek başlayın ve döşenen oligoları bir dizi üzerine sentezleyin. Oligolar diziden kaynatılarak ayrılır ve ilgilenilen bir RNP ile birlikte çöktürülür. Toplam başlangıç havuzu SCI 3 ile, bağlanan havuz ise SCI 5 ile işaretlenir ve her ikisi de tespit dizisine uygulanır.

Ardından dizi taranır ve sonuçları yorumlamak için özellik çıkarma yazılımı kullanılır. Tuzlar. Merhaba, ben Brown Üniversitesi MCB Bölümü'ndeki Will Fair brother laboratuvarından Kate Watkins. Bugün size, laboratuvarda prem RA üzerindeki bir RNA protein kompleksinin kesin konumunu belirlemek için hızlı ve düşük maliyetli bir prosedür göstereceğim, prem A'yı örtüşen oligonükleotid havuzu olarak yeniden sentezleyin.

Bu havuz daha sonra ko-immünopresipitasyon ile bağlanmış ve bağlanmamış fraksiyonlara ayrılabilir ve ardından bir mikroarray ile analiz edilebilir. Bu prosedürün birçok uygulaması olsa da, biz bunu birden fazla ekleme faktörünü ve bunların alternatif eklemedeki rolünü incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, prem A havuzunu tasarlamak amacıyla belirli genleri, ekleme bağlantılarını (splice junctions) veya ilgilenilen diğer bölgeleri indirmek için uc SC genom tarayıcısını kullanın. İlgilenilen pencereleri seçin, ardından her bir oligonun bir öncekinden 10 nükleotid kaydırılacağı şekilde, 30 nükleotid okuma uzunluğu ve 20 nükleotid örtüşme ile bu bölgeler üzerinde hesaplamalı olarak döşeme yapın. 30 nükleotid uzunluğundaki oligolar tanımlandıktan sonra, her birinin yanlarına evrensel primer dizileri ekleyin.

Özel bir oligonükleotid mikroarray üzerinde basılmak üzere oligoları Agilent'e gönderin. Mikroarray ulaştığında, array örtü lamını bir array hibridizasyon odasına yerleştirip lam üzerine nazikçe 500 µL deiyonize su pipetleyerek DNA oligolarını yüzeyden geri kazanma işlemine başlayın. Her bir lam üzerindeki etiketlerin birbirine bakmasını sağlayacak şekilde mikroarray lamını örtü lamının üzerine yüzüstü yerleştirin ve oligo geri kazanım sürecini bozabilecek hava kabarcıklarını önlemeye dikkat edin.

Hibridizasyon haznesini kapatın ve bir hibridizasyon fırınında 99 °C'de gece boyunca döndürün. Ertesi gün, diziyi hazneden dikkatlice çıkarın ve artık dizi yüzeyinden serbest kalmış oligoları içeren suyu çekin. Serbest kalan oligo havuzunu 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne yerleştirin ve potansiyel topaklanmaları parçalamak için %50 genlikte, her biri üç ila beş saniyelik üç kez sonikasyon uygulayın. Ardından, uçlarına T promotörü eklenmiş evrensel primerler kullanarak düşük döngülü PCR ile havuzu amplifiye edin.

Gerekli döngü sayısı, oligo geri kazanım verimliliğine bağlı olarak değişebilir. Akrilamid jelde yayılmış bir bant şeklinde görülen aşırı amplifikasyondan kaçının. Son olarak, RNA transkripsiyonu için Amon'un mega short script kitini kullanın.

RNA'nın fenil kloroform ekstraksiyonu ile transkripsiyon reaksiyonunu sonlandırın, ardından sodyum asetat ve taşıyıcı olarak glyco blue kullanarak etanol çöktürmesi yapın. RNA peletini 105 µL TE tamponunda yeniden süspande edin. RNA konsantrasyonunu doğru bir şekilde belirlemek için.

Bir standart eğrisi oluşturmak için ribo green kullanın. Ardından floresan plaka okuyucu ile ölçüm yapın. RNA havuzu, çöktürme işlemini başlatmak için ko-immünopresipitasyona hazırdır.

İlk olarak, reaksiyon başına 50 µL nihai hacme ulaşacak şekilde protein A ve protein G dyna bead'lerini bir bir oranında birleştirerek manyetik boncukları hazırlayın. Süpernatantı uzaklaştırmak için manyetik ayırma standı kullanarak boncukları tek bir noktada toplayın. Ardından, soğuk 1X PBS ile eşit hacimde iki kez yıkayın.

Boncukları eşit hacimde soğuk 1X PBS içerisinde süspande edin ve her porsiyon başına iki nanogram antikor ekleyin. Bu miktar antikora bağlı olarak değişebilir, bu nedenle antikoru boncuklara bağlamak için optimal koşulları bulmak amacıyla deneyler yapılması gerekebilir. Karışımı, döner bir platform üzerinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

Sabah saatlerinde, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için reaksiyon başına iki mikrogram sonikasyon uygulanmış maya toplam RNA'sı ekleyin ve dört derece Celsius'ta 30 dakika daha döndürün. Bloklama adımı tamamlandığında, süpernatanı uzaklaştırmak için tekrar manyetik rafı kullanın. Ardından boncukları soğuk 1X PBS ile iki kez yıkayın; ikinci yıkamadan kalan PBS tüpte kalacak şekilde boncuk karışımından 50 mikrolitre yeni tüplere ayırın.

Her bir co IP reaksiyonu için bir tüp. Boncuklar artık co ip için hazırdır. Ardından, RNA oligo havuzunu nükleer hücre özütü ile birleştirerek master mix'i hazırlayın.

RNP kaynağı olarak, toplam örnek koruma Primerleri için master mix'ten 50 µL'lik bir alikot alın; evrensel primerlerin RNA versiyonları olan bu primerler, proteinin primer dizisine bağlanmasını önlemek veya RNA'ya ikincil yapı kazandırılmasını engellemek için eklenebilir. Ko-immünopresipitasyona başlamak için, boncuk alikotlarındaki süpernatanı uzaklaştırın ve boncukları kalan master mix'in 120 µL'si içinde yeniden süspanse edin. Reaksiyonları 4 °C'de bir ila iki saat boyunca sallayın.

İnkübasyonun sonunda, boncukları da içerecek şekilde, her bir çöktürme tüpünden küçük bir miktar Eloqua alınabilir. Bağlanma verimliliğini veya özgünlüğünü ek olarak test etmek için, reaksiyonların geri kalanını mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, soğuk one XPDS ile bir veya iki kez yıkama yapın.

RNP aracılığıyla boncuklar üzerindeki antikora bağlı olan RNA, IP örneğidir. IP boncuklarını 0,1 XTE tamponu içindeki %1 SDS'li 50 µL çözeltide yeniden süspande edin ve örnekleri 65 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın. RNA'yı elüe etmek için, daha önce boncuklara bağlı olan RNA'yı içeren süpernatantı uzaklaştırın; fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürmesi ile temizleyin, ardından peleti 0,1 XT tamponu içindeki 50 µL çözeltide yeniden süspande edin.

Ardından, evrensel ters primerleri kullanarak örnekleri ters transkribe edin. Daha sonra, biri T7 promotörü içeren evrensel primerler ile örnekleri PCR ile amplifiye edin. Havuzu amplifiye etmek için gereken döngü sayısı, ko-ip verimliliğine bağlı olacaktır.

Ambion'un mega shorts script kitini kullanarak örnekleri tekrar transkribe edin, ancak bu kez kit ile birlikte gelen T seven UTP yerine iki µL amino allyl UTP ekleyin. Amino allyl UTP, daha sonra RNA'yı side eyes ile etiketlemek için kullanılacaktır. Transkripsiyon tamamlandığında.

Fenil kloroform özütü ve etanol örnekleri çöktürür. Örneklerin diziye hibridizasyonunu engelleyebilecek gliko mavi veya amonyum asetat kullanmayın. Peleti 4.5 µL 0.1 M sodyum karbonatta yeniden süspande edin.

Numuneleri etiketlemek için öncelikle toplam numuneye 2,5 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Üç µL S3 ekleyin ve IP numunesine üç µL SCI five ekleyin. Karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığında, her örneğe altı mikrolitre dört molar hidroksilamin HCL ekleyerek reaksiyonu sonlandırın, iyice karıştırın ve santrifüjleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kısa süreli inkübasyon yapın; ardından etiketli örnekleri fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürme ile saflaştırın. Rengin çoğu serbest nükleotidlerle birlikte organik faza geçtiği için peletler görünür şekilde renkli olmayabilir.

Her bir peleti 50 µL 0.1 XTE içinde süspande edin. Mikroarray örneğini hazırlamak için Agilent array hibridizasyon kiti talimatlarını aşağıdaki istisna ile takip edin. RNA'yı fragmante etmeyin. Fragmantasyon tamponu eklendikten hemen sonra, fragmantasyonu durdurmak için hibridizasyon tamponunu ekleyin.

Numuneleri diziye yerleştirin ve dizi dönerken 50 °C'de üç saat boyunca hibridizasyon yapın. 50 ml'lik konik tüplerde aşağıdaki 50 ml'lik çözeltileri hazırlayın: Bir tüp 2x SC tamponu, iki tüp 1x SC tamponu ve bir tüp deiyonize su.

Üç saatlik inkübasyonun ardından, array lama sandviçini dikkatlice klemplerden ayırın ve 2X SSC tamponu içerisine yerleştirin. Bir cımbız kullanarak array'i lamelden nazikçe ayırın.

Diziye dokunmamaya dikkat ederek lamelini nazikçe kaldırın. Lam dışarı çekilirken, konik tüpü kapatın ve 60 saniye boyunca nazikçe altüst edin. Cımbız kullanarak diziyi 1X SSC çözeltisine aktarın.

Tüpün kapağını kapatın ve bir dakika boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Ardından diziyi ikinci XSSC çözeltisine aktarın ve tekrar bir dakika boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Son olarak, diziyi deiyonize su tüpüne aktarın ve 30 saniye boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın.

Lamın kenarlarını bir kim wipe üzerine yerleştirerek diziyi kurutun. Oligoların bulunduğu tarafa zarar vermemeye dikkat ederek diziyi wipe üzerinde döndürmeye devam edin. Diziyi boş bir konik tüpe yerleştirin ve dizinin taranmasına geçin.

Diziyi tarama işlemine geçiniz. Burada temsili bir dizi yer almaktadır. Her bir özellik veya oligo, toplam zenginleştirilmemiş havuz için yeşil veya IP ile zenginleştirilmiş havuz için kırmızı ile renklendirilmiştir.

Her bir özellikteki sinyal, o kanalın toplam yoğunluğuna normalize edilir. Nihai çıktı, kırmızı kanalın yeşil kanala oranının logaritmasıdır. Dizideki her bir özellik için, her bir genomik koordinattaki ortalama skor belirtilen konuma eşlenir.

Sırasıyla iki, dört ve 0.5 skoruna sahip, birbiriyle örtüşen 30 nükleotitlik üç oligo için bu ortalama alma adımının bir örneği verilmiş olup, her 10 nükleotitlik pencere için ortalama zenginleştirme skoru gösterilmiştir. Burada, CLTA geni üzerindeki poli pirimidin bağlayıcı protein PTB için bir bağlanma şemasının örneği sunulmuştur; gen özellikleri alt kısımda verilmiş ve PTB ile bağlanan bölgelerin log ortalama zenginleştirme skorları koyu kırmızı dikey çubuklarla temsil edilmiştir. Açık kırmızı çubuklar, PTB bağlanması açısından zenginleştirilmemiş alanları göstermektedir.

Alternatif olarak eklenen eksonlar gibi ilgi bölgelerini kapsayan bir oligonükleotid havuzunun hızlı ve verimli bir şekilde nasıl oluşturulacağını size göstermiş oldum. Havuzlarımızı mikroarray ile analiz ediyoruz, ancak bunları Illumina, Lexi dizileme veya daha geleneksel olan Sanger dizileme yöntemiyle dizilemek de mümkündür. Bu prosedürü uygularken, havuzun oluşturulmasının hem RNA hem de protein düzeyinde modifikasyona açık olduğunu hatırlamak önemlidir.

RNA düzeyinde, oligonükleotid dizisine otolog bölgeler, hastalık mutasyonları, polimorfizmler veya rastgele mutasyonlar ekleyebiliriz. Protein düzeyinde, RNA bağlayıcı faktör fosforilasyon veya diğer translasyon sonrası modifikasyonlarla modifiye edilebilir. Ayrıca, ilgilenilen RNA bağlayıcı proteinle rekabete giren veya onunla etkileşime giren ek faktörlerin seviyelerini artırmak veya azaltmak için bağlanma ortamı manipüle edilebilir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.