RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA'lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu videonun amacı, immünopresipitasyon yöntemleri kullanılarak hücre ekstraktlarından ribonükleoprotein komplekslerinin RNA ve protein bileşenlerinin izolasyonu ve tanımlanması yöntemini göstermektir. Merhaba, adım Garrett Dom; Missouri Üniversitesi'nde, Dr. Eli sso yönetiminde Moleküler Mikrobiyoloji ve İmmünoloji bölümünde yüksek lisans öğrencisiyim. Yüksek kapasiteli dizilemedeki ilerlemeler ve verimli mikroarray analizleri sayesinde, küresel gen ekspresyonu ve analizi, birçok araştırma ve hastalık modelinde kolay ve hazır bir veri toplama biçimi haline gelmiştir.

Ancak, hedef gen mRNA'sının kararlı durum seviyeleri, her zaman kararlı durum protein seviyeleriyle doğrudan korelasyon göstermez. İkisi arasındaki bu farklılığın muhtemel açıklaması, RNA bağlayan proteinlerin etkileşimleriyle yönlendirilen transkripsiyon sonrası gen düzenlemesidir.

Transkripsiyon sonrası düzenleme, hedef mRNA'lar ile bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturarak mRNA lokalizasyonunu, stabilitesini ve translasyonunu etkiler. Bu kompleks içindeki bilinmeyen Denovo mRNA hedeflerinin hücresel ekstraktlardan tanımlanması, RNA bağlanma proteinlerinin mekanizmalarını ve işlevlerini ve bunların protein çıktısı üzerindeki sonuçlarını anlamak açısından kritik öneme sahiptir. Bu protokol, ribonükleoprotein kompleksinde ilişkili spesifik mRNA'ların tanımlanmasına olanak tanıyan, ribo protein immünopresipitasyon veya RIP olarak adlandırılan bir yöntemi özetlemektedir.

Deneye başlamadan önce tüm reaktiflerin, kapların ve gereçlerin hazır olması kritik önem taşır. Cam malzemeleri Ambion'dan RNA ZAP gibi bir RNaz inhibitörü ile işleyip ardından DEPC işlem görmüş su ile durulayarak RNaz'dan arındırın; tüm reaktiflerin RNaz içermediğinden emin olun. Prosedürün ilk adımı, hücresel lizattan ribonükleoprotein kompleksini hasat etmektir; kullanılan her bir örnek için iki ila beş miligram arasında toplam protein üretmek amacıyla eksponansiyel olarak büyüyen doku hücrelerini hasat edin, genellikle iki adet P150 kültür kabı yeterlidir.

Burada MB 2 31 ve MC seven insan meme kanseri hücre hatlarını hasat ediyor ve RNA bağlayıcı proteinin ribonükleik etkileşimlerini inceliyoruz. İncelenen her bir RNA bağlayıcı protein için, uygun hedef mRNA ve RNA bağlayıcı protein etkileşimlerini maksimize etmek amacıyla toplam hücre sayısı ve protein miktarlarının optimize edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Hücreleri 4 °C'de yaklaşık sekiz ila 10 dakika boyunca 1000 RPM'de santrifüj ederek çöktürün, ardından buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüpün altına hafifçe vurarak hücre peletini, RNase ve proteaz inhibitörleri içeren hazırlanmış polisomal lizis tamponu ile eşit hacimlerde yeniden süspande edin.

Hücre peletinin tam hacminin ölçülmesi, hücre kümelerini dağıtmak için karışımın pipetle nazikçe karıştırılması ve lizatın beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmesi önerilir. Lizatı kalıntılardan arındırmak için 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 G'de santrifüjleyin; ardından berraklaşan süpernatanı hemen önceden soğutulmuş RNase-free mikro santrifüj tüplerine aktarın, buz üzerinde tutun ve -80 °C'de saklayın.

Bu lizat, -80 °C'de altı aya kadar saklanabilir. Protein ve/veya mRNA degradasyonuna yol açabileceği için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. IP işleminin hemen yapılması en iyisidir.

Standart Bradford protein analizi kullanarak protein konsantrasyonunu ve lizatı hızlıca nicel olarak belirleyin. Ardından, ilgilendiğimiz spesifik proteinin izolasyonu için gerekli materyalleri hazırlamamız gerekecektir. İlk olarak proteini ön şişirme işlemine tabi tutun.

Spherosphere boncuklarını, %5 BSA ile desteklenmiş NT2 tamponunda gece boyunca 4 °C'de saklayın. NT2 tamponunu PAS boncukları ile 4:1 oranında kullanın. 4 °C'de birkaç aya kadar uzun süreli saklama mümkündür.

Kullanımdan önce %0,1 sodyum azid ile takviye edildiğinde, nihai boncuk-tampon oranı bire bir olacak şekilde fazla NT iki tamponunu uzaklaştırın. 1,5 mililitrelik RNA içermeyen mikro santrifüj tüpleri kullanarak, her bir bireysel IP reaksiyonu için 100 mikrolitre SRO hızlandırılmış bulamaç çıkarın ve 30 mikrogram antikor ekleyin. Örneğin, deneyimizde fare IgG1 antikoru olan who are antikoru kullanıyoruz.

Bu nedenle kontrol antikorumuz da IgG 1'dir. Ardından, antikor boncuk karışımına 100 ila 200 µL NT 2 tamponu ekleyin. Ek olarak, arka plan RNA'sına karşı bir antikor kontrolü olarak, paralel şekilde izotip eşleşmeli bir antikor veya aynı türe ait normal tam serum kullanılmalıdır.

Uygun antikoru boncuk karışımına ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta, uçtan uca döndürülerek gece boyunca inkübe edin. Kullanımdan hemen önce, antikoru kaplı boncukları bir mililitre buz gibi soğuk NT iki tamponu ile beş kez yıkayarak hazırlayın; boncukları dört derecede, 13.000 G'de bir ila iki dakika boyunca santrifüj ederek yıkayın. Süpernatantı el pipeti veya aspiratör ile dikkatlice uzaklaştırın.

Bu yıkama işlemi, antikor karışımındaki bağlanmamış antikorların yanı sıra RNA kontaminantlarının da uzaklaştırılmasına yardımcı olur. Son yıkama tamamlandığında, boncukları 700 µL buz gibi soğuk NT2 tamponu ile yeniden süspanse edin ve ardından hedef mRNA'ları korumak için 10 µL RNase inhibitörü, 10 µL 100 mM DTT ve 15 µL EDTA dahil olmak üzere çeşitli RNA inhibitörleri ile işlem uygulayın. NT2 tamponu ile hacmi 900 µL'ye tamamlayın.

Ardından, hedef kompleksi immünopresipite edeceğiz. RIP prosedürü sonrası RNA analizindeki arka plan sinyalini azaltmak için bir ön temizleme (pre-clear) adımı uygulanmasını şiddetle öneririz; 15 µg izotip kontrolü ile 4 °C'de 30 dakika boyunca ön temizleme yapın. Antikorla kaplanmamış 50 µL ön şişirilmiş PAS boncuğu ekleyin.

4 °C'de, rotasyonla 30 dakika inkübe edin ve ardından 4 °C'de 10.000 G'de santrifüjleyin. Pelleti ayırın. Süpernatantı IP için saklayın.

Ardından, yaklaşık iki ila beş miligram protein içeren 100 µL izole edilmiş berrak lizatı, hazırlanmış antikor karışımına ekleyin. Lizatı seyreltmek arka planı azaltmaya yardımcı olacaktır; tüpü kapatın ve sıkıca mühürlendiğinden emin olmak için parafilm kullanın ve 4 °C'de dört saat boyunca tumbling yöntemiyle inkübe edin. Ardından boncukları 4 °C'de 5.000 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün ve daha önceden açıklandığı üzere -80 °C'de saklayarak potansiyel analizler için süpernatantı kaydedin. Boncukları, 1 mL buz gibi soğuk TNT2 tamponu ile beş kez yıkayın ve santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı el pipeti veya bir aspiratör ile uzaklaştırın. Arka planı azaltmak için NT two tamponu sodyum deoksikolat, üre veya SDS ile desteklenerek daha katı yöntemler kullanılabilir. Hedef mRNA'nın bozunmasını en aza indirmek için numuneleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun ve hızlı çalışın.

Son olarak, ribonükleoprotein RNA'larını izole etmek için DNAse ve proteinaz K işlemlerini takiben RNA çöktürmesi uygulayacağız; yıkadıktan sonra boncukları, beş mikrolitre RNA-free DNAse I ile desteklenmiş 100 mikrolitre N NT iki tamponu ile yeniden süspande edin. Örnekleri 37 °C'de 5 ila 10 dakika bekletin. Bir mililitre N NT iki tamponu ekleyin ve 5.000 ×g'de beş dakika santrifüj edin.

SÜPERNATAN'ı atın; protein A SRO'lar peletini 100 µL NT iki tampon, 10 mg/mL konsantrasyonda 5 µL proteinaz K ve 1 µL %10 SDS ile yeniden süspande edin. Yeniden süspande edilen boncuk karışımını, her 10 dakikada bir hafifçe vurarak 55 °C'lik su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Proteinaz K, ribonükleoprotein bileşenlerinin salınımına yardımcı olacaktır. Boncukları peletleyin.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 5, 000 G'de santrifüjleyin, hacmi yaklaşık 100 µL olan süpernatantı toplayın. Ardından boncuklara 200 µL NT 2 tamponu ekleyip iki dakika boyunca 5, 000 G'de santrifüjleyin. Yaklaşık 200 µL süpernatant toplayın ve boncukları atın.

Süpernatantı birleştirin ve 300 µL alt tabaka asit fenol ekleyip vorteksleyin. Oda sıcaklığında bir dakika bekletin ve oda sıcaklığında maksimum hızda bir dakika santrifüjleyin. Üst tabakadan 250 µL toplayın.

Kontaminasyona neden olacağı için ara yüzeye dokunmamaya çok dikkat edin. RNA örneğine 5,2 pH'ında 25 µL sodyum asetat, 625 µL soğutulmuş %100 etanol ve 5 µL glyco blue karışımı ekleyin. İyice karıştırıp -20 °C'de gece boyunca saklayın.

Ek olarak, RNA'nın düzgün bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için glyco blue eklemek, bir taşıyıcı molekül görevi görerek ertesi gün RNA peletinin görünürlüğünü artıracaktır; tüpleri üç ila beş kez ters çevirerek karıştırın, ardından 4 °C'de 12.000 G'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Mavi pelete 1 mL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve ters çevirme veya vorteksleme yoluyla karıştırıp santrifüjleyin.

Numuneyi 4 °C'de 12, 000 G'de iki dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve 4 °C'de 12, 000 G'de bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Kalan %70 etanolü bir pipetle uzaklaştırın ve peleti havada kurutun.

Beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. 20 ila 40 µL RNAz ve DNAz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. Örnek artık NanoDrop spektrometrisi ile miktar tayini ve RNA izolasyonun ardından kantitatif gerçek zamanlı PCR veya mikro-dizi analizi gibi diğer alt uygulamalar için hazırdır; RNA bağlayan protein olan who'nun mRNA hedeflerini ve immünopresipitasyon sonucunda elde edilen zenginleşmeyi belirlemek için mikro-dizi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirilmiştir.

Western blot ile yapılan doğrulama, ribonükleoproteinlerin temiz bir şekilde izole edildiğini ortaya koymaktadır. Kantitatif PCR, IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında beta actin hedef mRNA'sının kat sayısı zenginleşmesini göstermektedir. Mikroarray analizi, meme kanseri hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-231 arasında benzersiz genetik profiller ortaya koysa da, ribonükleoprotein immünopresipitasyonu, grubumuzun yanı sıra birçok diğer araştırma grubu tarafından RNA bağlayan proteinler ile bunların mRNA hedefleri arasındaki etkileşimleri izole etmek ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kabul edilmiştir; doğası ve uygulaması gereği hassas olsa da, bu prosedürün doğru şekilde yürütülmesi, yakın zamana kadar keşif ve analiz için erişilemeyen bu ribonükleoprotein komplekslerinin izole edilmesini sağlayacaktır.