Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Bio flux sistemi, kontrollü makaslama akışı altında canlı hücre analizleri gerçekleştirmek için tasarlanmış otomatik bir cihaz ve mikroakışkan düzenektir. Bu sistem, mikron ölçekli akış hücresi cihazlarını SBS standart kuyucuk plakalarına entegre etmek için kuyucuk plakası mikroakışkan teknolojisini kullanır. BioFlex, yüksek kapasiteli ve düşük kan hacimleri ile trombosit adezyon ve agregasyon çalışmaları yürütmek için kullanılabilir.

Floresan boya ile işaretlenmiş tam kan kuyucuklara eklenir ve ardından kanallar boyunca akıtılır. Kontrollü makaslama akışı altında, ilaç bileşiklerinin ve diğer değişken parametrelerin varlığında trombosit adhezyonunu ve agregasyonunu nicel olarak belirleyen yüksek çözünürlüklü mikroskopi verileri üretilir. Merhaba, ben Flexion Biosciences'taki Ar-Ge laboratuvarından Mike Schwartz.

Bugün size trombosit adezyon analizlerinde mikroakışkan akış hücrelerinin kullanımıyla ilgili bir prosedür göstereceğiz. Bu protokolü laboratuvarımızda çeşitli vasküler biyoloji analizleri için kullanmaktayız. Hadi başlayalım.

Akış hücresi deneyini yürütmeden önce, BioFlux plakasının mikroakışkan kanalları ilgili bir protein kaplamasıyla hazırlanmalıdır; bu deneyde kolajen one kullanılacaktır. BioFlux plakasının 24 deneysel kanalının her biri, bu plaka için bir giriş kuyucuğuna ve bir çıkış kuyucuğuna bağlanır. Giriş kuyucuğu kanalı besleyen sol kuyucuk, çıkış kuyucuğu ise sağdakidir; kolajen one stok çözeltisini 200 µg/mL konsantrasyona seyreltin.

0,02 molar asetik asitte, kullanılan her kanal için 20 µL gerekecektir. Bu deney 11 kanal gerektirdiğinden, 200 µL kolajen kaplama hazırlayın. Bir kanal, mikro pipet ucuyla nazikçe tekrarlanan karıştırma işlemiyle kaplamasız bırakılır.

Sıvıyı kuyucuğun iç delik kısmına dağıtmak için bir mikropipet kullanarak her ilgili kanala 20 µL kaplama ekleyin. Burada sarı boya ile gösterildiği gibi ilgili mikroakışkan kanalı besleyin; trombosit adezyonu ve agregasyonu için negatif kontrol olarak kolajen içermeyen bir kanal ekleyin. Kolajen kaplama tüm ilgili kanallara eklendikten sonra, ara yüzü plakaya takın.

BioFlux 1000 arayüzünü kullanıyorsanız, her iki mandalı da sahneye sabitleyebilirsiniz. BioFlux 200 arayüzünü kullanıyorsanız, önce dört vidayı sıkın. Ardından, tüm vidalar yerleştiğinde, tork sürücüsünü kullanarak tamamen sıkın.

Tork sürücüsü maksimuma ulaştığında tıklama sesi çıkaracaktır. Bio Flux yazılımındaki manuel modu kullanarak, çıkıştan santimetrekare başına 2D oranında ilgili kanallara perfüzyon uygulayın. Giriş kuyusunu bulmak için mikroskopta düşük güçlü bir objektif kullanın ve karşıdaki iç punch'ın sıvı ile doluşunu gözlemleyin.

Öncelikle, birkaç dakika sonra iç zımba yavaşça dolan küçük bir sıvı miktarı görmelisiniz; giriş iç zımbası dolduğunda, yazılımdaki durdurma butonuna basarak tüm kanallardaki akışı durdurun. Plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca, bir saatlik inkübasyonun sonunda kullanılacak olan tam kanı hazırlamaya başlayabilirsiniz.

Kan hazırlandıktan sonra, ara yüzü kaldırın ve çıkış kuyusuna kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren bir mililitre PBS ekleyin. Çıkış kuyusundan santimetrekare başına iki din şeklinde perfüzyonu başlatın ve perfüzyonu 10 dakika boyunca sürdürün. 10 dakika sonra perfüzyonu durdurun. Ara yüzü kaldırdıktan sonra, hem giriş hem de çıkış kuyularındaki fazla PBS'yi uzaklaştırın.

İç zımbasını dolduran sıvıyı asla çıkarmayın. Kanalları tıkamak için her çıkışa bir mililitre bloklama solüsyonu ekleyin. Kullanılacak kuyucuk, çıkış kuyucuğundan santimetrekare başına iki din hızında perfüze edilmeli ve perfüzyona 10 dakika boyunca devam edilmelidir.

10 dakika sonra perfüzyonu durdurun ve ara yüzü kaldırın. Kanallar artık hazırdır ve plaka kolajen ile kaplanırken gün boyunca kullanılabilir. Bir saatlik inkübasyon sırasında, açlık durumundaki bir bireyden alınan taze insan kanı, görüntüleme ve plakaya aktarma işlemleri için hazırlanmalıdır.

Kan, sodyum sitratlı antikoagülan içeren tüplere alınmalı ve toplandıktan sonra üç saat içinde kullanılmalıdır. İlk olarak, DMSO içindeki 4 mM kalsiyum M stok çözeltisini, 1:1000 hacim/hacim dilüsyonunda kana ekleyin. 4 µM kalsiyum elde etmek için numuneler nazikçe altüst edilerek karıştırılır.

Ardından, kalsiyumla işaretlenmiş kandan bir mililitreyi on adet 1,5 mililitrelik mikrotüpe paylaştırın. Her tüpe istenen seyreltmede GP2B3 inhibitör antikoru ekleyin. Nazikçe ters çevirerek karıştırarak, antikorsuz bir negatif kontrol ve ilgisiz bir antikor içeren pozitif kontrol eklediğinizden emin olun.

Akış hücresi deneyini gerçekleştirmeden önce tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve her 10 dakikada bir nazikçe tersyüz ederek karıştırın. Kollajen için bio flux kontrol modülünde otomatik bir protokol kurulmalıdır. Birincisi, kanı çıkıştan 10 dakika boyunca on dokuz santimetrekare hızında akıtacak bir protokol oluşturun.

BioFlex 1000 iş istasyonunu kullanırken; istenen sahne konumlarının kazanımı, dalga boyu ve zaman atlamalı (time-lapse) ayarlarını içeren veri toplama parametreleri yapılandırılmalıdır. Bu protokol için tipik bir görüntü toplama planı, 10x objektif kullanılarak her 30 saniyede bir, toplam 10 dakikalık süre boyunca kanal başına bir görüş alanının yakalanmasını kapsamaktadır. Ek görüş alanları ve alternatif zaman atlamalı ayarlar da uygulanabilir.

Otomatik protokol ve veri toplama parametreleri ayarlandıktan sonra, BioFlex plakasına geri dönün ve iç delikler hariç kanalın her iki yanındaki sıvıyı uzaklaştırın. Hızlı çalışmaya dikkat ederek, her durum için 500 µL kanı her kanalın çıkış kuyucuklarına yerleştirin. Kanın görüntüleme bölgesine giden en kısa yol olduğu ve kanın kolajen kaplamaya daha hızlı tepki vermesini sağlayacağı için çıkış kuyucuklarının kanı iletmek amacıyla kullanıldığına dikkat edin.

Ek olarak, antikor içermeyen kontrol kanını, kolajen ile kaplanmış bir kanala ve yalnızca bloklanmış bir kanala yerleştirin. Plakayı BioFlex 1000 iş istasyonu mikroskobuna yerleştirin ve arayüze sabitleyin. Orijin olarak tanımlanan ilk kalibrasyon noktasını belirleyerek sahne listesi kalibrasyonunu gerçekleştirin.

Ardından ikinci kalibrasyon noktasını belirleyin ve işaretleyin. Bu kalibrasyonu uygun sahne listesine uygulayın. Bu işlem, plaka üzerindeki tüm görüntüleme konumlarının otomatik olarak bulunmasını sağlar.

Sahneyi, kan içeren kanallardan birine taşıyın; BioFlex montaj yazılımında pozlama süresi ve kazanç gibi görüntü yakalama parametrelerini ayarlayın. İlgili düğmeye tıklayarak uygun iş akışını başlatın. Bu işlem, akış protokolünü ve görüntü alımını eş zamanlı olarak başlatacaktır.

Deneyin sonunda, plakayı BIOFLU 1000 iş istasyonundan çıkarın ve kurumsal yönergeler doğrultusunda imha edin. Bio flux sisteminin kolajen kaplı mikroakışkan kanalları kullanılmıştır. İşlem görmemiş kontrol kan örneğinde, zamanla agresif trombüs oluşumu gözlemlenir.

Buna karşılık, kaplamasız kanalda trombüs oluşumu gözlenmez. Yakın zamanda gerçekleştirilen bir deneyde, kontrol koşulları altındaki agregatların ortalama boyutu 2000 µm² idi. GP IIb/IIIa, burada gösterildiği üzere, kolajene adezyon ile aktive olduğunda trombosit etkileşimlerinin ve agregasyon stabilizasyonunun güçlü bir medyatörüdür; kayma stresine maruz bırakılmadan bir saat önce anti-GP IIb/IIIa antikoru ile inkübasyon sonrası, trombüs boyutunda olduğu kadar trombüs oluşum frekansında da bir azalma gözlenir.

Genellikle 10 dyn cm⁻²'de doz bağımlı bir yanıt gözlemlenebilir ve bu özel inhibitör için IC₅₀ değeri 17 nM idi. Antikor içermeyen kontrol ile karşılaştırıldığında, bu donör için maksimum inhibisyon 10 dyn cm⁻²'de %11 idi. Tüm kan deneylerini 200 dyn cm⁻²'ye veya 5.000 s⁻¹'e kadar yürütmek için 48 kuyucuklu yüksek kayma plakası da mevcuttur.

Fizyolojik olarak ilgili vasküler biyoloji deneyleri gerçekleştirmek için mikroakışkan akış kanallarının nasıl kullanılacağını size gösterdik. Bu protokolü uygularken, kolajeni doğru tampon çözelti ile seyreltmeyi hatırlamak önemlidir. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için her zaman doğru pipetleme tekniğini kullanın ve laboratuvarınızın biyogüvenlik düzenlemelerine her zaman uyun.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.