Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Bu video makalesinin genel amacı,leukosit benzeri adherent hücreleri laminar akış koşullarına maruz bırakma tekniğini tanımlamak ve iyi şekilde quantify edilebilen akışkan kayma gerilmelerine verilen yanıtı değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle akış hücresi olmadan akış devresinin monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Devre; rezervuar darbe sönümleyiciyi, sert tüpleri, yumuşak tüpleri, dört yollu muslukları ve bağlantılı luer adaptörleri ile bir hava filtresini içerir.

Bir sonraki adım, devreyi steril koşullar altında hücre besiyeri gibi istenen bol sekizle doldurmak ve ardından darbe sönümleyiciyi doldurup borulardaki havayı tahliye etmek için pompayı çalıştırmaktır. Bunu, hücrelerin yerleştirildiği lamın akış odasının alt plakasına yerleştirilmesi izler. Prosedürün son adımı, akış odasının hat üzerinde olduğu akış devresinin tamamen monte edilmesidir.

Sonuç olarak, hücrelerin fonksiyonel davranışlarını incelemek amacıyla, floresan mikroskobu kullanılarak şeffaf bölme üzerinden sıvı kayma stresine maruz bırakılmış floresan işaretli endotelyal progenitör hücrelerin hizalandığını gösteren veriler elde edilebilir. Hücrelerin in vivo fizyolojisini taklit etmek için onları sıvı kayma stresine maruz bırakmak sıklıkla gereklidir. Hücreleri akış koşulları altında incelememize ve onları şeffaf bölme aracılığıyla gözlemlememize olanak tanıyan paralel plaka akış bölmesi ve sürekli akış devresi tasarladık.

Bu teknik, tıp ve mühendislik alanları için değerli bir araştırma aracı olarak hizmet edebilir. Akış hücremiz, dik veya ters mikroskop kullanılarak hücrelerin akış altındaki görüntülerinin kesikli veya gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır. Ayrıca, Dr. Ach Nick'in tasarımı, araştırmacıların standart mikroskop lenslerini kullanarak şeffaf veya radyoopak yüzeylerdeki hücreleri görüntülemesine imkan verir.

Ayrıca, ilaçların akış koşulları altındaki hücreler üzerindeki etkisini incelemek için farmakoloji araştırmalarında önemli bir araç olarak kullanılabilir. Kurulumun görselleştirilmesi kritiktir, çünkü adımların birçoğuna yalnızca bir protokol okuyarak hakim olmak zordur. Dr. Ock Next'in laboratuvarında yaygın olarak kullanılan akış odasının ve akış devresinin nasıl kurulacağına dair adım adım talimatlar vereceğim. Akış devresini monte etmek için.

Bir darbe sönümleyicinin bir ucuna 36 inçlik sert bir boru parçası takarak başlayın. Diğer uca 18 inçlik yumuşak bir boru parçası takın. 18 inçlik yumuşak boru bölümünün ucuna bir sekizden bir inçlik erkek luer adaptör yerleştirin.

Erkek bağlantı aparatını, bir sekizlik inçlik dişi bağlantı adaptörüne bağlayın. Dişi bağlantı aparatını, 18 inçlik yeni bir yumuşak tüp segmentine takın. 250 mililitrelik bir cam beher kapağına üç delik açın.

Hortumları yerleştirmek için, yumuşak hortumun 1,5 inçlik bir segmentini hava tahliye deliği olarak kullanılacak olan deliğe yerleştirin. Sert ve yumuşak hortumların boşta kalan uçlarını, kapaktaki diğer iki delikten geçirerek rezervuar görevi görecek olan 250 milliliter cam şişenin içine yerleştirin.

Sert borunun rezervuarın tabanına ulaştığından emin olun. Devrenin kurulumu boyunca steriliteye dikkat edilmesi, bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, tüm parçalar sterilize edilmeli ve işlem boyunca steril eldivenler kullanılmalıdır.

Montajı tamamlanan parçaların yanı sıra, şu parçalar da sterilize edilmelidir: Bir adet eksiksiz akış odası, üçle iki inçlik yumuşak boru segmentleri, bir adet erkek ve bir adet dişi bir sekiz inç luer adaptör, dört adet yarım inç düz başlı vida, 6 5 16 inç boyutunda, inç başına 30 dişli sekiz adet düz başlı vida, bir çift cımbız, bir lam ve buharla sterilize edilmiş iki havlu.

121 °C'de 60 dakika boyunca otoklavlama yapın. Akış devresi akış odasını, dörtlü stop kokları, tekli stop kokunu ve tüm sterilize edilmiş parçaları bu steril alana yerleştirin. Steril eldivenler giyilmiş haldeyken, iki adet dörtlü stop kokunu birbirine bağlayın.

Açık örnekleme portlarının üzerine kapakları yerleştirin. Akış devresinin iki yumuşak tüp segmentini birbirine bağlayan erkek ve dişi lure adaptörleri ayırın ve bağlı stopcock'ları yerleştirin. Rezervuara yerleştirilen yumuşak tüpü 30 mililitrelik bir şırıngaya takın ve şırınga pistonunu çıkarın.

Şişeyi 125 mililitre EPC ortamı ile doldurun. Yumuşak tüpü stopcock'a tekrar bağlayın. Hava tahliye deliğine steril bir şırınga filtresi yerleştirin.

Şimdi akış devresini 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Sert boruyu, bu tip coal Palmer borularıyla kullanım için belirtilen master flex rotorlu pompa kafasına sabitleyin. Borunun rotorlu pompa montaj raylarıyla üst üste gelmediğinden emin olun.

Pompa başlığının her iki yanından çıkan boruları bir markör kalemle işaretleyin. Tüm muslukların numune portlarına doğru kapalı ve akış devresi boyunca açık olduğundan emin olduktan sonra pompayı çalıştırın. Akış yönünü doğrulayın.

PERFUSE 8, cam rezervuardan sert boru aracılığıyla darbe sönümleyiciye doğru hareket etmelidir. Akış hücresi düzeneği için, iki inçlik bir yumuşak boru segmentini bir sekizde bir inçlik dişi luer adaptöre bağlamak için steril eldiven kullanın. Başka bir iki inçlik yumuşak boru segmentini bir sekizde bir inçlik erkek luer adaptöre bağlayın.

Dişi luer adaptörlü iki inçlik yumuşak tüpü giriş portuna, erkek luer adaptörlü iki inçlik yumuşak tüpü ise çıkış portuna takın. Bu luer adaptörlerin her ikisine dört yollu stop koklar takın. Kalan iki inçlik yumuşak tüp parçasını kabarcık tuzağından çıkan yan port konnektörüne bağlayın ve steril pens kullanarak bir tek yönlü stop kok takın.

Hücre ekilmiş lamı hücre kültür kabından çıkarın ve akış odasının alt plakasındaki oyuğa yerleştirin. Lamın hücre ekili tarafının yukarı baktığından emin olun; bir şırınga veya pipet kullanarak hücre ekili lamın üzerine 10 mililitre sıcak EPC medyumu ekleyin. Medyumun akış odasındaki lamı kaplamasına izin verin, ancak medyumun alt plaka üzerindeki O-ringasının dışına taşmamasına dikkat edin.

Vida deliklerini hizalayarak, akış odasının üst plakasını alt plakanın üzerine yerleştirin. Vida plakalarının içine hava kabarcığı girmemesi için iki plakayı birbirine paralel tutun. Otomatik pilli bir tornavida kullanarak, giriş tarafındaki kabarcık tuzağı portuna bağlı tek yönlü stop musluğu açarak giriş kabarcık tuzağındaki havayı tahliye edin.

Giriş borusunu EPC ortamı ile nazikçe durulamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın ve ardından bu stop kokunu kapatıp kapağını örtün. Şimdi, çıkış portu dört yollu stop kokunu açıp akış kanalı boyunca nazikçe EPC ortamı geçirerek kanal kanalındaki havayı tahliye edin. Tekrar 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak tüm dört yollu stop kokunu bağlantılarının kapaklarını kapatın ve bunları kilitleyin.

Akış hücresini, monte edilmiş akış devresiyle birlikte nemlendirilmiş inkübatöre aktarın. Akış devresi pompasını durdurun ve sızıntıyı önlemek için akış yönündeki akış devresi musluklarını kapatın.

Akış odasını akış devresine bağlayın. Akış odası akış devresine bağlandıktan sonra, durdurma musluklarını akış yönünde açın. Akış pompasını yeniden çalıştırın ve PERFUSE sekizinin doğru yönde aktığından emin olun. Akış hızını istenen kayma gerilimine göre ayarlayın.

Akış deneyi sırasında, hücreleri ışık veya floresan mikroskobu ile görüntülemek için akış odası devreden çıkarılabilir. Bunun için, akış odasını musluktan musluğa bağlantı noktalarıyla akış devresinden ayırın. Analiz için perfüzyon örnekleri toplamak amacıyla.

İlk olarak pompayı durdurun, darbe sönümleyiciye en yakın konumdaki stop musluğunu kapatın. Koruyucu kapağı çıkarın ve kontamine olmamasını sağlamak için ters şekilde yerleştirin. Örnekleme portuna küçük bir şırınga yerleştirin.

Örnekleme portu ve puls sönümleyici yönündeki devreyi açık tutarak, akış hücresi yönündeki musluğu kapatın. Devreden istenen miktarda örnek çekin ve şırıngayı çıkarmadan önce örnekleme portu yönündeki musluğu kapatın. Alınan sekiz örneği etiketli bir tüpe koyun ve -80 °C'de dondurun.

Akışı başlatmadan önce örnekleme portunun kapağını kapatın ve tüm muslukların açık olduğundan emin olun. Bu yöntem kullanılarak, insan kanından türetilmiş endotelyal öncül hücreler 15 dakika içinde titanyum lamlar üzerine ekilebilir ve fizyolojik kayma kuvvetleri altında tutunabilirler. Bu şekilde gösterildiği üzere, EPC'ler 15 dines per square centimeter sıvı kayma gerilimi etkisiyle, ekimden hemen sonra yaklaşık 210 square microns olan yayılım alanlarını üç saat sonra yaklaşık 657 square microns'a ve 48 saat sonra yaklaşık 1, 152 square microns'a çıkarmaktadırlar.

Bu ışık mikroskobu görüntüsü, insan EPC'lerinin rastgele yönelimini göstermektedir. Santimetrekare başına 100 dines akışın üç saat sürmesinin ardından altı saatlik statik oturma süresinden sonra, hücreler yayılmış ancak rastgele yönelimlerini korumuşlardır. Santimetrekare başına 100 dines akışkan kayma stresinin 48 saat uygulanmasının ardından, EPC'ler akış yönünde hizalanmış ve yönlenmişlerdir.

Burada EPC'ler, akış sonrası ölüm için CTO ile işaretlenmiş ve hücre çekirdekleri herx ile boyanmıştır. Karşılaştırma amacıyla, bu görüntü, akış yönüyle hizalanmış titanyum lamlar üzerindeki porsin EPC'lerini göstermektedir. 48 saatlik akış ve santimetrekare başına 15 dines kayma gerilimi maruziyetinden sonra, hücre sınırları anti pcam boyasıyla ve çekirdekler cytoxin nükleik asit boyasıyla boyanmıştır.

Bu yöntem ayrıca, salgılanan hücre metabolitlerinin analizi ve/veya nicelendirilmesi için PERFUSE eight'ten önceden belirlenmiş zaman noktalarında örnekler alınmasına olanak tanır. Burada, porcine EPC'ler ile yapılan 48 saatlik bir akış deneyi sırasında nitrit üretiminden bir örnek gösterilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, süreç boyunca sterilitenin korunması önemlidir.

Ayrıca, hücreleri koparabilecekleri için sürekli akış başlamadan önce akış odasındaki hava kabarcığı sayısını azaltmak adına gerekli önlemlerin alınması önemlidir. Deney sırasında PERFUSE eight sızıntısını önlemek için perfüzyon öncesinde akış odasındaki ve devredeki tüm bağlantıların tek tek kontrol edilmesini öneririz. Bu oda, üst ve alt plakaların tamamen karşı karşıya gelmesini sağlayan ve vakum pompalarına ihtiyaç duymadan sızdırmaz bir mühür sağlayan yerleşik O-ringlerle tasarlanmıştır.

Bu özellik, deneyler arasında sabit bir hazne yüksekliği sağlar ve kauçuk contalara veya ayarlamalara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Akış haznemiz standart mikroskop lamları kullanır. Bu sayede, sonraki deneyler için çok sayıda hücreye erişim sağlanmış olur.

Örneğin, akış sonrası hücrelerden elde edilen RNA ve DNA, protein sentezi veya gen ekspresyonu açısından değerlendirilebilir. Devre tasarımımız, analiz için sekiz perfüzyon örneğinin toplanmasına ve sıvı kayma stresine maruz kalan hücreler tarafından salgılanan nitrik oksidin temel oksidatif metaboliti olan nitrit gibi hücre metabolitlerinin miktarının belirlenmesine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, yapışkan hücreleri sıvı kayma stresine maruz bırakmak için akış odamızı ve steril akış devremizi nasıl monte edeceğiniz konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmanız gerekir.