Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

Bu sunumda, insülin sekretagoglarına yanıt olarak pankreas adacıklarının dinamik insülin salgısının, kalsiyum girişinin ve mitokondriyal potansiyel değişimlerinin eş zamanlı ölçümü için mikroakışkan tabanlı bir adacık perfüzyon sistemini tanıtacağız. Perfüzyon sistemi; üç katmanlı bir mikroakışkan cihaz, şırınga pompaları ve bir fraksiyon toplayıcıdan oluşmaktadır. Sekretagogların tetiklediği kalsiyum girişi ve mitokondriyal potansiyeller, floresan mikroskop düzeneği kullanılarak görüntülenmektedir.

Merhaba, benim adım Ola, Illinois Üniversitesi Chicago Kampüsü Transplant Cerrahisi Bölümü'nde Dr. Val Holter'in laboratuvarından bir araştırmacıyım. Merhaba, ben de Holter'in laboratuvarından Don Lee. Merhaba, ben de Dr. Val Holter'in laboratuvarından Tricia Hart.

Bugün sizlere doğrusal bir glikoz gradyanı kullanarak eş zamanlı göz kapağı görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Göz kapağı görsellerini ve fonksiyonlarını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullandık. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedür için kullanılan mikroakışkan aygıt, standart fotolitografi ile oluşturulmuş kürlenmiş PDMS'in üç katmanından monte edilmiştir. Silikon bir mastardan oluşturulan ilk katman, gözcükleri nazikçe yerinde tutacak, 150 mikrometre derinliğinde ve 500 mikrometre çapında mikroakışkan aygıt kuyucuklarına sahiptir. İkinci katman, 500 mikrometre yüksekliğinde ve iki milimetre genişliğinde kanallara sahiptir.

Çözelti değişimini iyileştirmek için akışı yaymak amacıyla kanalın orta kısmı genişletilmiştir. Cihazın içinde, katmanın ortasına üç milimetre yüksekliğinde ve yedi milimetre genişliğinde bir delik açılarak değişim kuyusu oluşturulur. Üçüncü katman, kalın bir PDMS plakadır. Bu katmanı hazırlamak için, kanalın giriş ve çıkışıyla hizalı olacak şekilde her iki tarafa küçük delikler açın.

Üç katmanın tamamı oluşturulduktan sonra, ikinci katman aşamasında, kuyucuklar yukarı bakacak şekilde ilk katman bir lam üzerine yapıştırılır. Ardından, kanal aralıkları yukarıya gelecek şekilde ikinci katman, ilk katmana yapıştırılır. Son olarak, üçüncü katman ikinci katmana yapıştırılır.

Katmanlar birbirine bağlandığında, cihaz deneylerde kullanılmaya hazır hale gelir. 70% etanol ile doldurulmuş ve Tygon borularla cihazın giriş portuna bağlanmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, etanolü cihaz kanallarından geçirerek mikroakışkan cihazı sterilize edin. Ardından, aynı düzeneği kullanarak etanolü temizlemek için deiyonize su akıtın.

Cihaz sterilize edildikten sonra, tigon borular kullanılarak ısıtmalı bir mikroskop tablasına yerleştirin; yüksek ve düşük glikoz çözeltileri içeren şırınga pompalarını bir Y konnektöre bağlayın. Ardından, bu konnektörü mikroakışkan cihazın girişine bağlayın. Mikroakışkan cihazın çıkışını ise bir fraksiyon toplayıcıya bağlayın.

Hortumun 37 °C'lik bir ısıtıcı tabla üzerinde olduğundan emin olun. Çözeltilerin deney boyunca fizyolojik sıcaklıkta tutulması oldukça önemlidir. Ardından, deney sırasında mikroakışkan ağ üzerinden perfüze edilecek glikoz gradyanını başlatmak için LabVIEW programını kullanın.

Bu yazılım, iki glikoz çözeltisinin akış hızını değiştirir. Şırınga pompaları kontrol edilerek burada doğrusal, çan şeklinde ve kare şeklinde çeşitli glikoz gradyan profilleri oluşturulabilir. Bu deneyde, hesaplanan beklenen değerlerle karşılaştırmalı olarak; iki glikoz çözeltisinin 0,01 milliliters per minute değişken akış hızıyla ve çözeltiler karıştırıldıktan sonra cihaza giren 0.25 milliliters per minute sabit akış hızıyla, 2 millimolar ile 25 millimolar arası doğrusal glikoz gradyanı kullanılacaktır.

Uygun gradyan profili seçildikten sonra, gradyanın stabilitesini test edin. İlk olarak gradyan sistemini başlatın. Ardından fraksiyon toplayıcıyı başlatın ve sekiz adet bir mililitrelik eppendorf tüpüne perfüzyon toplayın.

Ardından, bir glukometre kullanarak her tüpteki glukoz konsantrasyonunu test edin ve verileri Excel'e kaydedin. Glukometreden elde edilen sonuçları analiz edin. Daha sonra, yüksek glukoz içeren şırıngayı, Krebs ringer tamponu içinde %0.5 BSA çözeltisi içeren bir şırıngayla değiştirin ve cihazdan dakikada 1 mL hızla 50 mL PERFÜZYON gerçekleştirin.

Bu işlem, BSA ile perfüzyon sonrası salgılanan insülin seviyeleri daha sonra ölçülürken doğruluğu sağlamak amacıyla, insülinin mikrokanal duvarlarına spesifik olmayan absorbsiyonunu önleyecektir. Bunu yüksek glikoz çözeltisi ile değiştirin. Elle seçilmiş 25 ila 30 fare gözletini, kalsiyum indikatör boyası fira 2:00 AM ve mitokondriyal potansiyel indikatör boyası rumine 1 2 3 içeren 2 mM glikozlu Krebs ringer tamponu içinde süspande edin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, cihazı perfüzyon sisteminden ayırın ve adacıkları içeren pipet ucunu giriş portuna yerleştirerek adacıkları mikroakışkan cihaza dikkatlice yükleyin; yükleme işlemi tamamlandıktan sonra adacıkları yavaşça dağıtın ve cihazı perfüzyon sistemine yeniden bağlayın. Hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterin. Ardından, adacıkları 2 mM glukoz içeren KRB ile perfüze etmeye başlamak için şırınga pompasını çalıştırın.

Bu adımda, ortamdaki fazla boya yıkanacak, deney sırasında kullanılacak eksitasyon ve emisyon filtre setleri ile pozlama süreleri belirlenecektir. Ardından, düşük glukoz çözeltisiyle gözlemleri yaparken, fraksiyon toplayıcıyı bir dakikalık aralıklarla toplama yapacak şekilde ayarlayın. Görüntülemek istediğiniz alanları veya göz açıklıklarını tanımlamak için basit PCI görüntüleme yazılımındaki ilgi alanı veya ROI aracını kullanın.

Ayrıca, hücreler 10 dakika boyunca yıkandıktan sonra çıkarılacak olan arka plan alanını daire içine alın, glikoz gradyan fraksiyon toplayıcıyı başlatın ve zaman ayarlı (time-lapse) görüntülemeyi başlatın. 30 dakika sonra, yazılımı ve yüksek glikoz şırınga pompasını kapatın. Yüksek glikozun etkisini temizlemek için düşük glikoz ile perfüzyona devam edin.

10 dakika sonra, şırınga pompasını kapatarak düşük glikoz akışını durdurun. Perfüzyonun ardından, analiz için verileri excel'e aktarın. Perfüzata salgılanan insülin miktarı, ELA fare adacık kiti ile belirlenebilir.

Burada gösterildiği gibi, 2 ile 25 millimolar glikozdan oluşan doğrusal bir gradyan ile perfüze edildi. Kalsiyum girişi ve insülin salınımı, altı millimolar glikozla uyumlu olan yaklaşık 13 dakikalık perfüzyondan sonra tetiklenir. Mitokondriyal potansiyellerdeki değişimler, beklendiği üzere daha erken, yaklaşık 11. dakikada görülür.

Bu veriler, eyelet fizyolojisini karakterize etmek için bu mikroakışkan ağın kullanılmasının avantajını ortaya koymaktadır. Eyelet fizyolojisi çalışması için mikroakışkan parafüzyon cihazımızın nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, cihazda hava kabarcığı bulunmadığından emin olmak önemlidir; çünkü bu durum, deney sırasında eyeletlerin hareket etmesine neden olabilir.

Ayrıca, gözlemlere müdahale etmeden akış hızı dakikada 1 ml'ye kadar ayarlanabilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.