Beyin Dilim Uyarım mikroakışkan Ağ ve Standart Perfüzyon Odası

Bugün size göstereceğimiz projenin temel amacı, beyin dilim stimülasyonunu mekansal ve zamansal olarak kontrol edebilmektir. Bir diğer önemli nokta ise, halihazırda karmaşık olan elektrofizyolojik düzeneğe basit bir modifikasyon ekleyerek, bu mikroakışkan cihazı beyin dilim stimülasyonu kullanan çeşitli laboratuvarlara yayabilmemizdir. Merhaba, ben University of Illinois at Chicago Biyomühendislik Bölümü'ndeki Edington laboratuvarından Java Chek Mohammad.

Bugün sizlere, beyin dilimi stimülasyonu için basit, mikro üretimli bir mikroakışkan cihazın nasıl uygulanacağını göstereceğim. Bugün tanıtacağımız beyin dilimi cihazı birçok nedenden dolayı oldukça kullanışlıdır; temel nedenleri ise mevcut elektrofizyolojik düzeneğe herhangi bir ek modifikasyon gerektirmeden sığabilecek kadar modüler olması ve her mikroakışkan cihazı karmaşıklaştıran boru hatları ile pompalama sistemlerinin kullanımını ortadan kaldırmasıdır.

Pasif pompalama yöntemini kullandığımız için herhangi bir boru hattına veya pompaya ihtiyacımız yoktur. Üçüncü nokta ise, bunun standart bir elektrofizyoloji düzeneğinde kullanılan bir kapak camı ile standart bir perfüzyon odası arasına yerleştirilen ince bir PDMS membran tabakası olmasıdır. Bugün göstereceğim prosedür, standart SU-8 litografisi işlemi kullanılarak üretilen bir SU-8 mastarı ile başlamaktadır.

Bugün burada kullandığımız kalıp, bir katmanında mikro kanalların tasarımının, diğer katmanında ise kanallardan akan çözeltilerin dışarı çıkmasını sağlayan ve bu kanalların üzerine gelen via açıklıklarının tasarımının bulunduğu iki seviyeli bir kalıptır. Silikon gofret üzerinde olan bu kalıbı hazırlıyoruz ve ardından cihazın üzerine silikon veya PDMS dökerek gofret üzerindeki yapıları PDMS üzerine kalıplıyoruz. Şimdi bu cihazın üzerine PDMS dökme işlemini gerçekleştireceğiz.

Ardından, kürleme sonrası oluşan ve bir lam üzerine yapıştırılmış olan PDMS membranı alacağız. Böylece mikroakışkan cihazımız hazır olacak. Daha sonra, perfüzyon odasının tabanına ince bir PDMS tabakası kaplayarak standart bir perfüzyon odasını modifiye edeceğiz.

Modifiye edilmiş perfüzyon odasına sahip olduktan sonra, daha önce hazırladığımız mikroakışkan cihazı alıp perfüzyon odasına yapıştıracağız. Mikroakışkan cihazın hazırlanmasında iki kritik nokta vardır. Bunlardan biri, PDMS'yi yerleştirmeden önce, PDMS'yi wafer üzerine döktüğümüzde anında kürlenmemesi için ısıtıcı plakanın kapatılmış olmasıdır.

Bir diğer kritik nokta ise, silikon gofretin dört köşesinde kullandığımız ara parçaların yüksekliğinin, silikon gofret üzerindeki en yüksek yapıdan daha düşük olması gerektiğidir. Bu, PDMS için kürleme işlemi yaptığımızda VR açıklıklarının elde edilebilmesini sağlamak içindir. Şu an bu yumuşak duvarlı modüler temiz odadayız ve bu da standart bir C8 litografi işlemi kullanarak hazırladığımız kalıptır.

Bu, birinci seviyesi dört girişi ve bir çıkışı olan kanal tasarımına sahip, iki seviyeli bir masterdır. Dört kanalın tamamının orta bölgesinde, kanalların üzerinde yer alan vialar veya direkler bulunmaktadır. Bunlar, fabrikasyon sürecinde oluşturulan hizalama işaretleridir.

Şimdi size bunu nasıl çıkaracağımı ve PDMS kürlemesini nasıl yapacağımı göstereceğim. Kenar boncuklanma etkisi (edge bead effect) nedeniyle, wafer'ın dış çevresindeki kalınlık, kağıdın merkezindeki gerçek cihazlardan daha fazladır. Bu nedenle, hizalama işaretlerini bir jilet kullanarak çıkaracağız ve ardından ağırlıkları yerleştirmek için 140 micron yüksekliğindeki bu ara parçaları (spacer) kullanacağız; bunları wafer'ın dört köşesine yerleştireceğiz.

Bu nedenle, jiletin gerçek cihazların yakınına ulaşmadığından emin olmanız gerekir. Şimdi, hava püskürtücü kullanarak bu SVA partiküllerini temizleyeceğim ve wafer artık PDMS kalıp hazırlığı için hazır hale gelecek. Ancak bunu yapmadan önce, 140 micron yüksekliğindeki şu ara parçaları yerleştirmemiz gerekiyor.

Şimdi dört bandı wafer'ın dört köşesine yerleştireceğim. Ardından, bandın wafer'a düzgün bir şekilde yapıştığından emin olacağım. Bant yüksekliğinin 140 mikron olmasının sebebi, kanalları ve VS'yi içeren iki seviyeli master'ın 150 mikron yüksekliğinde olmasıdır.

PDMS kürlenme işlemi sırasında ağırlığı PDMS'in üzerine yerleştirdiğimizde, PDMS tabakasının düz çıkmasını sağlamak isteriz. Bu nedenle köşelerde eşit yükseklikte dört adet ara parça kullanıyoruz. Şimdi cihazları üretmek için PDMS'i nasıl kaplayacağımızı ve kürleyeceğimizi göstereceğim.

Ancak bunu yapmadan önce, PDMS çözeltisini nasıl hazırladığımızı göstereyim. Temel malzemeden 10 birim ve kürleme ajanından bir birim alıp iyice karıştırıyoruz; karıştırma işlemi sırasında PDMS çözeltisinde çok sayıda kabarcık oluştuğunu göreceksiniz. Bu kabarcıkları gidermek için PDMS'i desikatöre yerleştireceğiz. PDMS'i 10 dakika boyunca desikatörde tuttuktan sonra kabarcıklar yok olur.

Artık PDMS, kürleme işlemi için hazır. Şimdi size PDMS'in gofret üzerine nasıl yerleştirileceğini ve PDMS membranını elde etmek için nasıl kürleneceğini göstereceğim. Bu nedenle PDMS'i gofretin üzerine koyacağım ve ardından PDMS'i örtmek için bu şeffaf filmi kullanacağım.

Bu işlem, destekleyici düzeneği kaldırmamıza ve cihazı şeffaf tabakadan ayırmamıza yardımcı olacaktır; ardından şeffaf tabakanın üzerine ağırlıkları yerleştireceğim. Ağırlıkları kullanmamızın nedeni, PDMS'nin homojen bir kalınlıkta olmasını sağlamaktır. Bir diğer kritik konu ise via açıklıklarını elde etmektir.

Bu nedenle, boşlukların olduğu her yerde PDMS olmamasını istiyoruz ve ağırlıklar bunu yapmamıza yardımcı olacak. Burada gördüğünüz üzere, ısıtıcı tabla kapalı; bunun nedeni PDMS'in anında kürleşmesini istemememizdir, bu yüzden kapalı bırakıyoruz. Ardından, PDMS'i dökmeden önce wafer'ın düz olduğundan emin olmanız gerekir.

Şimdi daha önce hazırladığımız PDMS'i aktarabiliriz. Kabarcık oluşumunu önlemek için PDMS'i gofretin yeterince yakınına boşalttığınızdan emin olun. Buradaki en kritik nokta, şeffaf folyoyu PDMS'in üzerine yerleştirme biçiminizdir.

Tabakayı yerleştirirken hava kabarcığı oluşmadığından emin olmanız gerekir. Şimdi bu cam desteklerden birini yerleştireceğim ve fazla PDMS'in dışarı çıkmasını sağlayacağım. Cam desteklerin bu özel master üzerinde hareket etmediğinden emin olmak için üç cam destek daha yerleştiriyorum.

Ve bu belirli özellikler için, dört adet cam bloğun yerleştirilmesinin, şeffaf katman ile wafer arasındaki fazla PDMS'in dışarı çıkmasını sağladığını saptadık. Bir ila iki dakika bekliyoruz ve ardından sıcak plakayı çalıştırabiliriz; farklı kalıplar ve farklı tasarımlar için, via açıklıklarını elde etmek amacıyla cam blok sayısını artırmanız veya azaltmanız gerekebilir. Şimdi sıcak plaka açılmaya hazır ve sıcaklığı 75 °C olarak ayarlayacağım.

Sıcaklık 75 dereceye ulaştığında, zamanlayıcıyı bir saate ayarlayabilir ve PDMS'in kürleşmesini bekleyebiliriz. PDMS'i bir saat boyunca kürleşmeye bıraktıktan sonra, ısıtıcıyı kapatabilir ve 50 santigrat dereceye kadar soğumasını bekleyebiliriz. Bunun nedeni, SEA'nın çatlamasını önlemektir.

75 dereceden oda sıcaklığına hemen çıkarmak yerine, şimdi cihazı kapatıp 50 santigrat dereceye düşmesini bekleyebiliriz. Isıtıcı plaka sıcaklığı 50 santigrat dereceye düştüğünde, şeffaf levha üzerindeki ağırlıkları kaldırabiliriz. Artık gofret tabakasını ısıtıcı plakadan alabiliriz; kesilmeye hazırdır.

Şimdi PDMS tabaka C sekiz kalıbından çıkarılmaya hazırdır ve alüminyum folyoyu çıkarmamız gerekir. Ardından şeffaf tabakayı çıkarmamız gerekir. Burada standart perfüzyon odasına sahibiz.

Hizalayabilmek için üzerinde değişiklik yaptık. Mikroakışkan cihazın delikleri, giriş ve çıkış portları. Dolayısıyla bunlar, PDMS membran üzerindeki dört giriş portu ve bir çıkış portudur.

Bunlar, perfüzyon odasındaki dört giriş ve bir çıkışla eşleşmelidir. Şimdi perfüzyon odasını kaydıracağım ve ardından PDMS membran üzerindeki deliklerle hizalayacağım. Artık hizalandıklarına göre, kesilmeye hazırdır.

Şimdi hazneyi dışarı çıkarabilir ve bir prob kullanabilirsiniz. PDMS membranın tüm kenarlarının çıkarılmaya uygun olduğundan emin olun. Bunu yaptıktan sonra, PDMS membranı çıkarmak için bir dondurucu kullanabiliriz; PDMS'yi cihazın üzerinden çıkarırken, PDMS membranı yırtmamak için PDMS'yi çok yavaş hareket ettirdiğinizden emin olun.

Şimdi, SC sekiz masterlar ile oluşturulmuş boşluklara sahip PDMS membranı üste yerleştirip düz olduğundan emin olacağım. Bunu yapmamızın nedeni, giriş ve çıkış portları olan delikleri açtığımızda, PDMS'in kapatma lameli ile bağlanacak olan kısmının pürüzlü olmamasıdır.

Bu nedenle boşlukların üst tarafta olduğundan emin olmamız gerekiyor. Şimdi, delikleri net bir şekilde görebilmek için giriş ve çıkış portlarını oluşturabiliriz. Siyah bir arka plan ekliyoruz.

Şimdi giriş ve çıkış portlarını oluşturacağım; portlarda hiç PDMS kalmadığından emin olmam gerekiyor. Bu nedenle, herhangi bir PDMS kalıntısını temizliyoruz. Şimdi PDMS membranı başka bir şeffaf levha üzerine aktaracağız.

Böylece tabakayı ve lamı plazma ile işlemden geçirebilir ve boşluklar yine üstte kalacak şekilde yerleştirebiliriz. Bu yüzey ve lam plazma ile işlendikten sonra, PDMS tabaka arasındaki hava kabarcıklarını gidermek amacıyla mikroakışkan ağı oluşturmak için bu iki yüzeyi bir araya getirebiliriz. Saydamlığı sağlamak için ise scotch bant kullanılabilir.

Böylece PDMS tabakasının düz olduğundan ve bağlanmanın çok daha iyi gerçekleştiğinden emin olunur. Ardından, PDMS membranındaki tüm tozları temizlemek için üst yüzeyde tekrar şeffaf bant kullanın. Artık PDMS membranla bağlayacağımız lameli yerleştirebiliriz.

Ve şimdi bu iki PDMS ve cam, plazma işlemine hazır. PDMS ve lameli, cam haznesinin mikrodalga içinde plazma oluşturmamıza olanak tanıdığı bu mikrodalga modifiyeli plazma sistemini kullanarak plazma işleminden geçireceğiz. Numuneleri içeri yerleştirip hazne içinde vakum oluşturuyorum.

Şimdi oksijen akışını sağlayabilirim. Artık plazma sistemi çalışmaya hazır; plazmayı görselleştirmeye yardımcı olması için bu özel sistemde %10 gücü ve 10 saniyeyi kullanacağım. Plazma işlemi devam ederken, gücü yüzde yüze çıkardık ve ışıkları kapattık.

Şu anda plazma işleminin hemen ardından plazmayı görebilirsiniz. Cam lam ve PDMS'in her iki yüzeyini de birbirine bağlamanız gerekir, aksi takdirde PDMS yüzeyi plazma işlemi nedeniyle hidrofilikliğini kaybedecektir. Cam lamı yerleştirdiğinizde, tüm yüzeyin hava kabarcığı kalmadan birbirine bağlandığından emin olun.

Herhangi bir hava kabarcığı varsa, bunları uzaklaştırabilirsiniz. Şimdi beş dakika boyunca kenara ayırın ve bağlanmasını bekleyin. Burada, tabanını PDMS ile modifiye ettiğimiz modifiye perfüzyon odasına sahibiz.

Bu işlem daha önce gerçekleştirildi. Kapatılmış olan bir ısıtıcı tabla üzerine bir şeffaf levha yerleştirdik. Ardından, daha önce gösterilen benzer bir yöntemle hazırlanan P-D-M-S'yi üzerine döktük.

Ardından perfüzyon odasını PDMS'nin üzerine yerleştirdik, burada gösterildiği gibi tek bir ağırlık koyduk ve 75 °C'de 30 dakika boyunca kürlenmeye bıraktık. Şimdi, PDMS ve lamel arasındaki bağlanmanın gerçekleşmesini beklerken, odayı hazırlayabileceğimizi göstereceğim. Böylece odayı ve mikroakışkan cihazı birbirine bağlayabiliriz.

Bu nedenle, ihtiyaç duymadığımız her yerden fazla PDMS'i temizlememiz gerekiyor. Önce şeffaf filmi, ardından PDMS'i kaldırın. Daha sonra giriş ve çıkış portlarındaki PDMS'i temizlememiz gerekir. Artık hazne, daha önce hazırladığımız mikroakışkan cihazla yapıştırılmaya hazırdır.

Beş dakika beklediğimize göre, mikroakışkan cihazı şeffaf folyodan ayırmaya hazırız; ancak folyoyu yavaşça çıkardığınızdan emin olmanız gerekir. Böylece PDMS ve lam birbirinden ayrılmaz. Perfüzyon odası hazır olduğuna göre, PDMS'yi az önce kapladığımız odanın alt yüzeyini ve üzerinde PDMS bulunan mikroakışkan cihazın üst yüzeyini plazma ile işlememiz gerekiyor.

Şimdi her iki parçayı da plazma odasına yerleştireceğiz ve %10 güçte 10 saniye boyunca plazma işlemi uygulayacağız. Artık her iki yüzey de plazma ile işlenmiş durumdadır ve yapıştırmaya hazırdır. Yapıştırma işleminden önce, odadaki giriş ve çıkış portlarının mikroakışkan cihazla hizalandığından emin olmanız gerekir.

Hizaladığımız özellikler yeterince büyük olduğu için herhangi bir özel ekipmana ihtiyaç duymayız ve bunu çıplak gözle yapabiliriz. Hizalayıp odanın üzerine yerleştirdikten sonra, tüm yüzeylerin temas ettiğinden emin olun ve ardından beş dakika boyunca bekletin. Beş dakika bekledikten sonra bağlanma, deneyler için yeterli olacaktır.

Mikroakışkan cihaz hazne ile birleştirildiğine göre, kanal yüzeyindeki kanalları hidrofilik hale getireceğiz. Böylece, A CFS çözeltisini veya diğer nörotransmitterleri akıttığımızda, çözeltiler daha kolay akabilecektir. Bunun için tüm cihazı plazmaya yerleştireceğim ve iç kanal yüzeylerinin tamamının hidrofilik hale gelmesi için %10 değerinde bir dakika boyunca plazma işlemi uygulayacağım.

Ardından içini suyla dolduracağım ve ardından gerçek deneyleri yapabilmemiz için elektrofizyoloji düzeneğine götüreceğim. Tamam, şimdi elektrofizyoloji düzeneğine gitmeye ve bu cihazı beyin kesiti ile gerçekten kullanmaya hazırız. Merhaba, benim adım uo.

Illinois Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'nden Dr. Arrington ve Dr. Fall ile çalışıyorum. Şimdi getirdiğim mikroakışkan cihazla, bu platform üzerinde çalışacağım. Bir tarafta perfüzyon tüplerini görebiliyoruz.

Diğer tarafta emme tüpünü görebiliriz. Cihaz, %95 oksijen ve %5 CO2 ile kabarcıklandırılmış bir CSF solüsyonu ile perfüze edilecektir. Mikro V cihazı hazır olduğuna göre, beyin dilimlerini alacağım ve ardından onları mikro cihazın üzerine yerleştireceğim.

Şimdi beyin kesitini dairesel açıklıkların üzerine yerleştireceğim ve ardından beyin kesitini sabitlemek için ankrajı kullanacağım. Beyin kesiti sabitlendikten sonra, onu uyarmak için nörotransmitterler kullanacağım. Burada dört giriş mevcut; bu nedenle, bu dört girişten çıkışa kadar olan pasif pompalama yöntemini kullanarak her girişe nörotransmitter ekleyeceğim.

Şimdi Dr. Fall bu cihaz hakkında konuşacak. Bizim için neden bu kadar önemli? Merhaba, ben Chris Fall ve beyin fizyolojisi üzerine çalışıyoruz.

Beyin dilimleri kullanmamızın nedeni, mikroelektrotlar ve görüntüleme teknolojisi ile erişim sağlamaktır. Şu ana kadar, bu beyin dilimleri için nörotransmitter ortamını değiştirmenin tek yolu, tüm dilim üzerindeki akışı değiştirmek veya çok küçük bir mikropipet kullanarak nörotransmitterleri doğrudan püskürtmekti. Bu nedenle, Eddington grubuyla çalışmaktan büyük heyecan duyuyoruz.

Bu yeni teknoloji, beynin geniş alanlarına müdahale etmemize ve nörotransmitter ortamını yerel olarak değiştirmemize olanak tanıyacak. Ardından, eş zamanlı olarak elektrotlarımız ve görüntüleme teknolojimizle giriş yapabilir ve belki de zamanla aynı üniteye çoklu elektrot kayıt cihazları entegre edebiliriz. Tamam, burada mikroakışkan cihaz içindeki bir fare beyni kesitini görüyorsunuz.

Beynin birçok farklı bölgeden oluştuğunu gözle bile fark edebilirsiniz. Bu bölgeler farklı işlevler gerçekleştirir. Canlı hayvanda, beynin bu farklı bölgeleri farklı nöromodülatör ve nörotransmitter tonlarına sahip olacaktır.

Elektrofizyolojik ve görüntüleme kayıtları yaparken bunu dilim odacığımızda tekrarlayabilmek istiyoruz. Dolayısıyla, farklı nörotransmitterleri farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman seyirleriyle bu farklı bölgelere uygulayabilmek gerçekten çok faydalıdır. Nörotransmitterleri gerçek anlamda görselleştiremesek de, burada beyin diliminin farklı bölgelerine pompalanan floresan boyadan bir örnek gösterebiliriz.

Burada, cihazın kanalları boyunca floresan boyanın akışını ve boyanın oluşturulmuş gözeneklerden dışarı çıkışının görselleştirildiği bir video görmektesiniz. Bu erken prototipte bile, akışla birlikte uzamsal çözünürlüğün ne kadar hassas olduğunu görebilirsiniz. Videoyu izlerken boyanın kanallara ve ardından deliklerden dışarıya aktığını göreceksiniz; sonrasında bu boyayı yıkayarak temizleyeceğiz, böylece akışın zamansal çözünürlüğü hakkında bir fikir edinebileceksiniz.

Bugün bize katıldığınız için teşekkürler. Beynin nasıl çalıştığını anlamamıza yardımcı olmak amacıyla, mikroakışkanların ve hatta mikro makinelerin geleneksel fizyolojik tekniklerle nasıl birleştirilebileceğini gösterdiğimizi düşünüyorum. Teşekkürler.