Işık Mikroskop ile İncelenen Presynaptically Sessiz Sinapslar

Merkezi sinir sistemindeki bazı presinaptik terminaller işlevsiz veya sessiz görünmektedir. Burada, sessiz presinaptik terminallerin belirlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, terminalleri sessizleştirdiği veya uyandırdığı şüphelenilen tedavilerin ve manipülasyonların belirlenmesinde uygulanabilir.

Bu protokol, nöronal depolarizasyon sırasında sinaptik veziküllerin canlı boya ile işaretlenmesini, ardından fikse edilmiş hücrelerin hem sessiz hem de aktif tüm presinaptik terminalleri işaretleyen bir antikorla işaretlenmesiyle birleştirir. Hem boya hem de antikorla ortak olarak işaretlenen sinapslar aktiftir. Yalnızca antikorla işaretlenen sinapslar ise sessizdir.

Merhaba, ben Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Psikiyatri Bölümü'nden Dr. Steve Minick'in laboratuvarından Amanda Taylor. Ben de Manic Lab'dan Shahin. Bugün size, kültürlenmiş hipokampal nöronlar kullanılarak sessiz presinaptik terminallerin görüntülenmesi prosedürünü göstermek istiyoruz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, elektriksel aktivitenin ve diğer tekil sinyal yollarının nörotransmitter salınımını nasıl modüle ettiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Steril bir laminar akış kabininde, dissosiye hücre kültürleri hazırlamak için postnatal 0 ila 3 günlük sıçan veya farelerden HIPA kullanarak örnekler alın.

Yayımlanmış protokolümüze göre, aynı diseksiyondan elde edilen karışık glial kültürlerimiz, her biri 5 mg/mL kolajen ile kaplanmış 0 numara lameller içeren steril 35 mm'lik kaplara ekilmelidir. Nöronlar, santimetrekare başına yaklaşık 500 hücre yoğunluğunda ekilir.

12 sıçan yavrusu genellikle 30-35 milimetrelik kaplar sağlayacaktır. Kültürlerin bir kültür inkübatöründe 10 ila 14 gün boyunca büyümesine izin verin. Sinaptik gelişim ve olgunlaşma için, in vitro dördüncü günde glial büyümeyi durdurmak amacıyla anti-mitotik a C ekleyin.

Ayrıca, in vitro beşinci günde, bu olgunlaşma dönemi boyunca nöronal sağkalımı artırmak için Neurobasal ortam ve B 27 takviyesi ile yarı ortam değişimi gerçekleştirin. Presinaptik olarak sessiz sinapsların sayısını değiştiren işlemleri uygulayın. Glutamat sinapslarının büyük bir yüzdesini sessizleştirmenin kolay bir yolunun, 30 millimolar potasyum ile dört saatlik bir işlem olduğunu saptadık.

Kültürler olgunlaştığında, nöronlar nispeten düşük bir yoğunluğa, iyi ayrılmış ve yaygın nörit uzantılarına sahip olmalıdır. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve tezgaha getirin. Kültür ortamını, 45 millimolar potasyum klorür ve 10 micromolar FM 1 43 FX boyası içeren tamponlu bir salin çözeltisi ile değiştirin.

Tekrarlayan sinyalleri önlemek için bu çözelti ayrıca NBQX ve APV içermelidir. Fotobeyazlamayı önlemek adına FM 1 43 FX stok çözeltisinin ve deneylerin karanlıkta tutulması önemlidir. Bu nedenle, sonraki tüm inkübasyon aşamaları boyunca kültür kaplarını folyo ile kapatın.

Oda sıcaklığında tam olarak iki dakika boyunca inkübe edin. Boya çözeltisini uzaklaştırın ve spesifik olmayan boyama bağlarını gidermek için 500 µM AZIDE içeren fosfat tamponlu tuzlu su ile sadece üç ila beş saniye boyunca yıkayın; bu adımdaki zamanlama kritiktir.

Adv adverse F seven'ye uzun süre maruz kalmak, tüm FM 43 FX etiketlerini kaldıracaktır. Ardından, bir kimyasal çeker ocak içerisinde hücreleri, adv adverse seven içermeyen tamponlu tuzlu suyla ikişer dakikalık beş aralıkla yıkayın.

Kültürleri PBS içinde %4 paraformaldehit ve %0,2 glutaraldehit ile 10 dakika boyunca fikse edin. Hücreleri kısaca PBS ile yıkayın. Hücreler artık çeker ocaktan çıkarılabilir.

Arka plan gürültüsünü azaltmak ve immün boyama için hücreleri permeabilize etmek amacıyla %4 normal keçi serumu ve %0,04 tritton X içeren bloklama solüsyonu ekleyin. 15 dakika inkübe edin. Hücreleri, bloklama solüsyonu içinde 1/2000 oranında seyreltilmiş vlu T one antikoru ile boyayın.

Kültürleri antikor ile üç saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Hücreleri dört kez PBS ile yıkayın. Hücreleri Alexa ile inkübe edin.

Bloklama çözeltisi ile 1:500 oranında seyreltilmiş 6 47 konjuge anti Gine domuzu antikoru. Kültürleri, sekonder antikor ile birlikte 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak bekletin. Hücreleri PBS ile dört kez daha yıkayın.

Pens kullanarak temiz bir lam üzerine küçük bir damla flor miktarını yerleştirin. Bir lamellenin ucundan tutup nazikçe, hücreler lama bakacak şekilde damlanın üzerine indirin. Lamın gece boyunca kurumasına izin verin.

Konfokal lazer tarama mikroskobunda 60 x yağ daldırma objektifini hazırlayın. Lamı, lamellenin objektife bakacak şekilde sahneye yerleştirin. Aşırı yoğun olmayan ve kalıntı boya tutabilen somadan uzak bir nörit alanı bulun.

Görüş alanı boyutunu 51 by 51 mikron olarak ayarlayın. Görüntüleme yazılımını kullanarak, her adım için 0.3 mikronluk 27 adımda 7.8 mikron derinliği kapsayan bir ZS yığını (ZS stack) elde edin.

Alandaki tüm glutamaterjik sinapsları tanımlamak için önce VLU T one antikoru için tarama yapın. Ardından, görüntüleme sonrası analizler için FM 1 43 FX floresansı için yeniden tarama yapın. Her piksel kümesi için belirlenen eşik değerine göre, herhangi bir plandaki maksimum yoğunluk okumasını temel alarak Z yığınını kompozit tek düzlemli bir görüntüye dönüştürmek için analiz yazılımını kullanın.

Arka planı azaltmak için, FM 1-43 efekt boyasına referans vermeden VG glu T 1 terminallerini belirleyin. Ardından bu punctaları ilgi bölgeleri olarak işaretleyin. Genellikle her alan için 10 PUNTA seçeriz.

FM 1 43 etkileri görüntüsü üzerinde eşikleme ve puncta seçimini tekrarlayın ve sessiz sinapsları belirlemek için görüntüleri üst üste bindirin. Aktif FM 1 43 pozitif sinapsları, inaktif FM 1 43 negatif sinapslardan ayırmak için mutlak bir piksel kriteri veya yüzde piksel kriteri kullanılabilir. Bizim kültürlerimizde, V glut one boyaması ile tanımlanan glutamat sinapslarının %70 ila %80'inin, yeşil FM 1 43 floresansı ve kırmızı V glut one boyamasının üst üste bindirilmiş görüntülerinde tespit edilebilir FM 1 43 boyaması sergilediğini görmekteyiz.

Bu durum, birlikte yerleşmiş markörlerle sinaps yapan çok sayıda sarı noktasal yapı olarak belirgindir. Bunlar oklarla gösterilmiştir. Kırmızı V glut one pozitif noktaların yaklaşık %20 ila %30'u, baz çizgisinin üzerinde yeşil FM 1 43 floresansı göstermeyecektir.

Bunlar inaktif presinaptik terminallerdir ve bir örneği ok ucuyla gösterilmiştir. Üçüncü bir sinaps popülasyonu da gözlemlenecektir. Bunlar yeşil FM 1 43 floresansı için pozitif, ancak kırmızı B glut one boyaması için negatiftir.

Bunlar aktif GABAergik sinapslardır ve bir örnek yıldız ile belirtilmiştir. Bunlar analizlerimizin çoğundan hariç tutulmuştur ancak veziküler GABA taşıyıcı antikoru kullanılarak açıkça incelenebilirler. VLU T bir antikoru yerine, FM 1 43 ve VLU bir immün boyama kullanarak presinaptik olarak sessiz sinapsların nasıl görselleştirileceğini size göstermiş olduk.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, FM 1 43 FX'in hem adver sub seven yıkama süresine hem de bloklama solüsyonuna eklenen X 100 uygulama konsantrasyonuna karşı hassas olduğunu unutmak önemlidir. İşte tümü bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.