İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Hipoksik insert cihazı, altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleşen altı sütuna sahiptir. Gaz, sütunun tabanındaki mikroakışkan ağ üzerinden akar ve gaz ağı ile kültür ortamını ayıran gaz geçirgen PDMS membran boyunca difüze olabilir. Bu cihaz, oksijen kaynağı (sütun tabanındaki mikroakışkan ağ) ile hücreler arasındaki difüzyon yol uzunluğunu minimize ederek oksijen konsantrasyonunun daha hızlı dengelenmesini sağlar.

Cihaz ayrıca, foto maskeler kullanılarak standart fotolitografi ile oluşturulan mikroakışkan gaz ağı tasarımı tarafından belirlenen, hücrelerin maruz kaldığı oksijenin uzaysal deseni üzerinde çok daha fazla kontrol sağlar. Merhaba, ben Illinois Üniversitesi Chicago Kampüsü Biyomühendislik Bölümü'ndeki Dr. David Edington laboratuvarından Sean Ard. Merhaba, ben de Edington Laboratuvarı'ndan Ellie.

Bugün size, altılı plakadaki in vitro hücre kültürlerini farklı oksijen konsantrasyonlarına maruz bırakmak için özel bir cihazın nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, oksijenin yara iyileşmesi, reaktif oksijen türleri oluşumu ve migrasyon üzerindeki etkilerini incelemek için kullandık. Öyleyse başlayalım.

Oksijenlendirme insertinin üretimine başlamak için, ön polimer ve kürleme ajanı arasında 10'a bir oranında Polimetil Siloksan veya PDMS hazırlayın. Üretici talimatlarına göre, PDMS karışımı, standart altı kuyucuklu kültür plağının şeklini taklit edecek şekilde desenlenmiş, önceden işlenmiş bir kalıba eklenir. 75 °C'de gece boyunca kürlendikten sonra, ortaya çıkan replika kalıplanmış sütun dizisi, oksijenlendirme insertini oluşturan üç bileşenden ilkini oluşturacaktır; oksijenlendirme insertinin ikinci ana bileşenini üretmek için.

Bir SU-8 master kalıbı, öncelikle SU-8 2150 spin kaplama yöntemiyle hazırlanır. Silikon bir gofret üzerine fotomaske uygulanır ve mikrokanal kalınlığı 300 µm olacak şekilde bir master kalıp oluşturmak için SU-8, fotomaske aracılığıyla UV ışığına maruz bırakılır. SU-8 Master'ın üzerine PDMS dökülür ve her bir sütunun tabanında mikrokanalları oluşturacak olan pozitif kalıbı elde etmek için 75 °C'de iki saat boyunca kürlenir.

Cihazın üçüncü bileşeni, önce 10 saniye boyunca 500 RPM'de, ardından 100 mikrometre kalınlığında bir membran elde etmek için 30 saniye boyunca 900 RPM'de bir silikon gofret üzerine PDMS döndürülerek üretilir. PDMS gaz geçirgen olduğu için, oksijen bu membran aracılığıyla doğrudan mikro kanallara iletilebilir. Tüm bileşenler hazırlandığında, her bir yapıştırma yüzeyine bir dakika boyunca oksijen plazma işlemi uygulanır.

Bir el tipi plazma cihazı kullanarak önce altı mikrokanal bileşenini pillar dizisine yapıştırın, ardından gaz girişleri ve çıkışları olarak hizmet edecek şekilde her pillar üzerinde iki delik açın. Son olarak, yapıştırmayı kolaylaştırmak ve varsa hava kabarcıklarını tahliye etmek için membranı mikrokanalın altına yapıştırın. Plazma ile işlem görmüş yüzeyler, bir cımbızın ucu kullanılarak yaklaşık bir dakika boyunca birbirine bastırılır; cihazın tamamen yapıştığından emin olmak ve kalibre edilebilmesini sağlamak için her yapıştırma işlemi arasında bir saat beklenir.

Tam bir cihaz üretildikten sonra, gerçek deneylerde oksijenlendirme eklemi kullanılırken hücrelerin aldığı oksijen seviyesinin kalibre edilmesi gerekir. Kalibrasyon için, oksijen tarafından sönümlenen floresan rutenyum boya kaplaması içeren floresan bir oksijen sensörü veya foxy lamı kullanın. Foxy lamları, altı kuyuklu bir plaketin tabanına sığacak şekilde önceden kesilmiştir.

Foxy lamı, kuyu yüzeyinin mümkün olduğunca büyük bir kısmını kaplayacak şekilde kesilmelidir. Foxy lam yaklaşık bir milimetre kalınlığında olduğundan, yeterli membran difüzyonu için istenen mesafeyi koruyacak şekilde cihazı modifiye edin.

Bu mesafe deneye bağlıdır, ancak çoğu durum için el tipi plazma cihazı kullanılarak bir milimetrenin altında olmalıdır; bir milimetre kalınlığında cam mikroskop lamı kullanarak yaklaşık altı milimetre uzunluğunda ve dört milimetre genişliğinde destekler kesin ve bunları cihazın altına yerleştirin. Cihaz, lam üzerindeki bu desteklerin üzerinde duracaktır.

Oksijen kullanımını doğrulamak için 0,17 milimetrelik bir difüzyon boşluğu amacıyla cam lameller de kullanılabilir. Oksijenin ölçüleceği altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarına oda sıcaklığında üç mililitre deiyonize su ekleyin. Cihazı plakanın içine yerleştirin ve metamorph yazılımını kullanarak foxy sensörü üzerindeki istenen konumların sayısını ve yerini seçin.

Oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için lamı kaydırın. Oksijen gaz tankı ile hipoksik ekleme cihazı arasındaki tai gun borusunu bağlayın. Verilen gazın hassas kontrolü için dakika başına 50 ila 100 mililitre akış hızına ayarlanmış bir hassas akış düzenleyici kullanılır.

Hassas akış regülatörünün kapalı olduğundan emin olun. Önce tank üstü regülatörü, ardından hassas regülatörü açın. 15 dakika sonra akış hızını dakikada 10 ile 20 arasına düşürün.

Suda kabarcık oluşumunu önlemek için, sistem dengelenirken basınç düşüşü değişeceği ve bu durum plak ile foxy sensörlerin görüntülerini yakalamak için akış hızını değiştireceği için, önümüzdeki bir saat boyunca akış hızı değerini yakından izleyin ve gerektiğinde ayarlamalar yapın. Floresans donanımlı bir Olympus IX 71 mikroskobu, Q Imaging Tiga'dan bir şarj bağlılı cihaz (CCD) kamera, SRV ve Metamorpho görüntüleme yazılımları kullanılmıştır. Mikroskop, 475 nanometre uyarım dalga boyuna ve 600 nanometre emisyon dalga boyuna sahip, foxy uyumlu bir floresan filtre olan Olympus 3 1 0 2 0 ile donatılmıştır.

Cihazın dengelenme süresini ve oksijenasyon derecesini test etmek için, foxy lam üzerinde oksijen konsantrasyonunun ölçüleceği üç nokta seçin. Gaz akışını başlatmadan hemen önce lamın bir görüntüsünü yakalayın. Heterojenliği ve oksijen iletimini test etmek için, gaz cihazdan akarken 30 dakika boyunca 10 saniyelik aralıklarla görüntüler yakalayın.

Kanal genişliği boyunca bir milimetre aralıklarla birden fazla nokta belirleyin ve metamorph kullanarak kuyucuk yüzeyindeki oksijen konsantrasyonunu ölçün. Her konum için ortalama görüntü yoğunluğunu dışa aktarın ve oksijenasyon konsantrasyonunu floresan yoğunluğuna bağımlı olarak grafiğe dökün. Floresan yoğunluğunu oksijen konsantrasyonuyla ilişkilendiren %0 ila %10 hattına ve %10 ila %21 hattına doğrusal eğriler uydurarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Ölçülen her bir konum için ham yoğunluk verileri metamorph'tan dışa aktarılabilir ve Microsoft Excel veya diğer istatistiksel yazılımlarla daha detaylı analiz edilebilir.

Cihaz kalibre edildikten sonra, yara iyileşmesi deneyleri gibi çalışmalara başlanabilir; kalibre edilmiş inserti deneyden önceki 24 saat içerisinde 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın ve sonraki kontaminasyonları önlemek için laminar akışlı kültür kabininde çalışın. Gaz kabarcıklarını önlemek için sterilize edilmiş PDMS inserti, plaka kuyucuklarına yerleştirmeden önce 24 saat boyunca serumsuz ortamda bekletin. MDCK hücrelerini veya diğer yapışkan hücreleri altı kuyucuklu bir plakada %100 konfluensle kültüre edin; tek katmanlarda P 200 pipet ucuyla düz çizikler oluşturun. Bu çizikler, yapışkan tek katmandaki yaraları simüle eder.

Monotabakayı bozmadan hücre besiyerini aspire edin ve beş mililitre besiyeri ile durulayın. Tekrar aspire edin ve kuyucukları üç mililitre serumsuz besiyeri ile doldurun. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek cihazı plakaya nazikçe yerleştirin.

Cihazın yerleştirme sırasında açılı tutulması, kabarcıkların bir taraftan dışarı atılmasına yardımcı olur. PDMS'yi, alttaki hücreleri ezebilecek kadar deforme edebilecek aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Plakayı ve cihazı 37 °C sıcaklığa ısıtılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin ve gaz kaynağı tankından gelen tüpleri cihazın giriş ve çıkış portlarına bağlayın.

Kültür inkübatöründe tüplerin girişine izin verecek bir delik bulunmalı ve tüpler bağlanmalıdır. Cihaz inkübatöre yerleştirildikten sonra, yara iyileşmesini değerlendirmek için gaz akışını başlatmak üzere önceden açıklanan prosedürü izleyin; önceden açıklanan ekipman ve görüntüleme yazılımını kullanarak hücrelerin her 20 dakikada bir, 15 ila 18 saat boyunca zamanla hızlandırılmış görüntülerini yakalayın. İstenen deney süresinin ardından, iyileşmemiş yüzey alanını analiz etmek için bir çizik yara ölçüm algoritması kullanılabilir. Gaz akışını durdurun, plakayı çıkarın ve istenirse hücrelerin ileri işlemlerine geçin. Hipoksik insert cihazının, burada gösterildiği gibi %0,5 oksijen seviyesinde stabilize olması iki dakikadan kısa sürer.

Cihaz membran kuyucuk taban boşluk boyutu, dengeye ulaşma verimliliğini belirlemede kritik bir faktördü; daha büyük boşluk boyutlarının, kararlı durum oksijen konsantrasyon değerlerine ulaşmak için daha fazla zamana ihtiyaç duyduğu görülmüştür. Cihaz ayrıca, tek bir kuyucuktaki mekansal oksijenasyon üzerinde yüksek düzeyde kontrol sağlayarak birden fazla koşulun oluşturulmasına ve hatta kuyucuk yüzeyi boyunca döngüsel bir oksijen profilinin üretilmesine olanak tanır. MDCK hücre tek tabakaları %10 veya %21 oksijene maruz bırakılmış ve yaranın yüzey alanı, MATLAB Ts çizik yara izleme algoritması kullanılarak zaman içinde analiz edilmiştir.

Toplam 17 saatin 11 saati sonunda, %10 oksijene maruz kalındığında orijinal yaranın %6,87'si kalırken, %21 oksijen altında yaranın %64,4'ü kalmıştır. Burada gösterildiği üzere, her iki oksijen konsantrasyonu için de oksijen konsantrasyonları ile yara açıklık alanı arasında negatif bir korelasyon vardır. Deney süresi boyunca, çizik yara iyileşme analizi için hipoksik insert cihazının nasıl üretileceğini, doğrulanacağını ve kullanılacağını göstermiş olduk. Cihaz, daha küçük bir laboratuvar alanı kaplaması ve hücre yüzeyindeki uzamsal ve zamansal oksijenasyon üzerinde çok daha fazla kontrol sağlaması gibi, diğer oksijenasyon sistemlerine göre bir dizi avantaj sunmaktadır.

Cihaz, oksijenin veya karbondioksit gibi diğer gazların in vitro hücre kültürleri üzerindeki etkilerini inceleyen hemen hemen her laboratuvar tarafından kullanılabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, sterilize edilmiş cihazın ve kültür ortamının gece boyunca bekletilmesi ve deney sırasında kabarcık oluşumunun minimize edilmesi önemlidir. Ayrıca, deneye başlamadan önce sistemin dengelenmesine izin verin.

Bunun nedeni, sistemdeki basınç dengelendikçe akış hızının değişmesidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.