Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, Corning Hypers istif kaplarının doğru kapalı sistem kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle kapların yer çekimi besleme yöntemiyle medya ile aşılanması ve doldurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücre süspansiyonu her bir katmanda izole edilir ve hücreler inkübe edilir.

İnkübasyonun ardından, kullanılmış besiyeri uzaklaştırılır. Prosedürün son adımı, hücrelerin hypers stack kaplarından hasat edilmesidir. Sonuç olarak, hypers stack kapalı sistemi kullanıldığında, hücrelerin konfluens düzeyine kadar olan büyüme sürecinde oksijene erişim yeteneğini göstermek amacıyla gaz difüzyon sonuçları elde edilir.

Gaz geçirgen malzemeli hypers stack kabının temel avantajı, hücre büyümesi için artırılmış yüzey alanı sağlamasıdır. Kabın içindeki boş alanı ortadan kaldırarak, meslektaşım p pardo şimdi hypers stack kabı kullanımı için kapalı sistem protokolünü gösterecektir. Hypers stack kabı, üst plaka ve gaz geçirgen filmden oluşan bireysel hücre kültürü bölmesi olan bir stattan meydana gelir.

Hücreler bu bölme içerisinde kültüre edilir. Sıvı manifold, bir modül içindeki ette katmanlarının her birini birbirine bağlar. Modüller, 12'nin katları şeklinde katmanlara sahip kaplar oluşturmak için hortumlarla birbirine bağlanır.

Manifold, kullanıcının tüm kap boyunca tek bir akışkan manipülasyonu yapmasına olanak tanır. Hava manifoldu ayrıca stat katmanlarını birbirine bağlar, ancak akışkan eklemeleri sırasında kaptaki havayı uzaklaştırmak için kullanılır ve her bir dolum işlemi arasında kullanılmak üzere bir dolum hattı içerir. Stat katmanı, her katmanın gaz geçirgen filmi aracılığıyla gaz değişiminin gerçekleşmesini sağlayan ve trakeal boşluk olarak adlandırılan açık bir hava boşluğudur.

Sıvı aktarım borusu, sıvı manifolduna bağlıdır ve steriliteyi korurken fazla havayı tahliye etmek amacıyla tüm kapalı sistem sıvı manipülasyonlarını gerçekleştirmek için kullanılan özelleştirilebilir bir bileşendir. Havalandırma borusu kullanılır. Havalandırma borusu, hava manifolduna bağlıdır ve bir hava filtresi içerir.

Sıvı aktarım tüplerine, kabın doldurulmasından sonra sıvı aktarım tüplerindeki sıvıyı tahliye etmek için kullanılan takip tüpü ve filtre bağlıdır. Ayrıca bu protokolde, kullanım sırasında kapların doğru konumlara yerleştirilmesine yardımcı olan bir taşıma cihazı olan Corning Stack manipülatörü veya CSM kullanılmaktadır. Bu gösterimde, gaz geçirgen 36 katmanlı bir kap için kapalı sistem hücre kültürü uygulaması gösterilmektedir.

Ancak, bir CSM kullanıldığında, dolum kaması kullanılarak 12 katmanlı bir kapta bu prosedürün gerçekleştirilmesine ilişkin ayrıntılar beraberindeki yazılı protokolde bulunabilir. Medya tüpünü inoküle etmeden önce 3,9 litre torbalanmış medya hazırlayarak başlayın. Serum torbasını medya torbasına ekleyin ve istenen serum konsantrasyonunu elde etmek için iyice karıştırın.

Büyük torba klempleri kullanarak torbadaki medyanın yaklaşık 300 mililitresini klempleyerek kapatın. Bu işlem, doldurma sırasında inoküle edilen tüm hücrelerin kullanılmasını ve medya torbasında hiç hücre kalmamasını sağlayacaktır. Medyayı inoküle etmek için medya torbasını bir torba standına yerleştirin.

Hücre süspansiyonu ile boru hattına bağlı bir şırıngayı doldurun. Hücre süspansiyonu içeren şırıngayı, tüp kaynağı yöntemiyle medya torbasına bağlayın. Şırıngadan torbaya kadar 16 inçlik borunun üç katını kullanın.

Hücre süspansiyonunu medya torbasına enjekte edin ve iyice karıştırın. İnoküle edilmiş medya torbası, tüp kaynağı veya çok amaçlı konnektörler kullanılarak düzeneğin üç sekizde bir inçlik sıvı aktarma borusuna bağlanabilir. Bugün tüp kaynağı yöntemini kullanacağız.

Kabın sıvı aktarım ve tahliye tüplerindeki klempleri kapatın. 36 katmanlı kabı CSM'deki yükleme konumuna yerleştirin. Havalandırma filtresi tüpünü CSM üzerindeki tutucu klempe takın.

Dolum işlemi sırasında ıslanmayı önlemek için hava filtresini en yüksek konuma getirmek amacıyla, kapağı sıkın ve CSM'yi dolum konumuna getirin. 10 derecelik açı, dolum sırasında dolum hattındaki havayı tahliye ederek sıvının katmanlar arasında dengelenmesini sağlar. Chase tüpü klempi kapalı tutarak, medya torbasını kap ile aynı seviyeye konumlandırın.

Sıvının kaba girmesini sağlamak için sıvı aktarım tüpü klempsini ve besiyeri torbası klempsini açın. Hücre süspansiyonunun kaba akışına yardımcı olmak için torba standını kullanarak besiyeri torbasını yukarı kaldırın. İnoküle edilmiş besiyerinin tamamı kaba girene kadar kabı doldurun.

Medya torbasının üst kısmında hâlâ 300 mililitre medya bulunmalıdır. Sıvı üst hava manifolduna yaklaştığında, kabın doldurulmasına devam etmek için medya torbasındaki klempi çıkarın. Aşırı dolumu önlemek için medya torbasını aşağı indirerek dolum hızını yavaşlatın.

Sıvı seviyesini yavaşça dolum çizgisine getirin ve sıvı aktarım tüplerini kıstırın. CSM içindeki kabı, her iki manifold setini de en yüksek konuma getirerek izolasyon konumuna alın. Besiyeri torbasını kabın yüksekliğinin altına indirin.

Chase filtresi dik konumda tutulurken, chase tüp klempsini açın. Bu işlem, sıvı taşıma tüpündeki medyanın boşaltılmasını veya chase yöntemiyle medya torbasına geri gönderilmesini sağlayacaktır. Tüpler boşaldığında, medya torbası tüpü üzerindeki klempsi kapatın.

Chase tüpü filtresi dik konumda tutulur. Kalan sıvının kaba girmesini ve dengelenmesini sağlamak için kabın sıvı aktarım tüpündeki klempi açın. Bu işlemin gerçekleşmesi için bir ila iki dakika bekleyin.

Ardından, manifoldlar solda kalacak şekilde CSM içindeki kabı çevirin. Kabı CSM üzerindeki yükleme konumuna indirin. Hem takip hem de sıvı taşıma borularındaki klempleri kapatın.

Besiyeri torbası artık kaptan çıkarılabilir veya hasat prosedüründe daha sonra kullanılmak üzere bağlı bırakılabilir. Bağlı besiyeri torbasını saklamak için, besiyeri torbasını rulo yapın ve kabın saklama tepsisindeki sabitleme bantlarının altına yerleştirin. Son olarak, kabı inkübatöre taşıyın. Kabı taşırken, hava tahliye filtresine herhangi bir sıvının girmemesine dikkat edin.

Bu işlem, manifold ucunun hafifçe yukarı kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. Hasat prosedürüne başlamak için, hücreler Ayrıştırma solüsyonu ve quenching torbalarını birbirine kaynatın. Hasat torbası düzeneğini oluştururken, tüm boru klemplerinin kapalı olduğundan emin olun. Kabı inkübatörden çıkarın ve CSM'ye yükleme konumunda yerleştirin.

Medya torbasını tutucu bantların altından çıkarın ve askıya asın. Yanında durarak, kabı sabitlemek için kapağı sıkın. Havalandırma borusunu tutma klemposuna takın ve CSM'yi doldurma konumuna getirin.

Besiyeri torbasının torba askısında kaptan daha aşağıda asılı olduğundan emin olun. Besiyerinin bağlı olan torbaya akmasını sağlamak için besiyeri torbası borusundaki ve kabın sıvı aktarma borusundaki klempi açın. Kap yaklaşık dörtte üç oranında boşaldığında, CSM ayarlarını nihai boşaltma konumuna getirin.

Kap ve sıvı taşıma tüpleri boşaldığında, besiyerini harcanmış besiyeri torbası tüpündeki klembin ötesine itmek için tüpleri yukarı kaldırın. Ardından hem sıvı taşıma tüpündeki klembi hem de harcanmış besiyeri torbası tüpündeki klembi kapatın. Harcanmış besiyeri torbasını, tüp kaynağı yöntemiyle hasat torbası düzeneği ile değiştirin.

Torba standını kullanarak hücre ayrıştırma torbası düzeneğinin yüksekliğini kabın yüksekliğinin üzerine çıkarın. CSM'yi doldurma konumuna getirin. Hücre ayrıştırma solüsyonu tüp klempsini ve hasat torbası düzeneği klempsini açarak solüsyonu kaba aktarın.

Transfer işlemi tamamlandığında, sıvı aktarım borularındaki ve hücre disosyasyon solüsyonu borularındaki klempleri kapatın. Ardından, yatay konumlandırma kolunu açık tutarak CSM'yi yükleme konumuna getirin. Çarkı kullanarak kabı nazikçe iki yana sallayın ve solüsyonu hücre katmanlarına yayın.

Çözeltinin eşit dağılımını sağlamak için sallama işlemi sırasında kap ara ara doldurma konumuna geri getirilebilir. Çözelti yeterince dağıtıldıktan sonra, doldurma konumunda kilitlemek için CSM üzerindeki kolu serbest bırakın. Hücreler için gerekli olan dissosiyasyon süresi boyunca kabı bu konumda bırakın.

Hücre kopmasını belirlemek için kılavuz olarak bulanıklığı kullanın. Kopma gerçekleştiğinde, CSM'yi yükleme konumuna getirin. Söndürme medyasının kaba girmesini sağlamak için söndürme torbası klambini ve sıvı taşıma boru klambinini açın.

Sıvı aktarım hortumundaki klempi kapatın. Aktarım tamamlandığında, CSM'yi yükleme konumuna geri getirin ve kabın yan kısmını sağa sola sallamak için yatay konumlandırma kolunu tutun. Torba standını kullanarak, hasat torbası düzeneğinin konumunu kabın seviyesinin altına indirin.

CSM'yi boş konuma ayarlayın. Kap sıvı transfer borusu kelepçesini açın ve hücre solüsyonunu söndürme torbasına geri aktarın. CSM'yi yükleme konumuna getirin ve hasat torbası düzeneğini bir boru kapatıcı kullanarak kaptan ayırın.

Hücre solüsyonu artık geleneksel hücre büyüme sistemlerinde işlenmeye hazırdır. Headspace ile, medyadaki oksijen üç gün boyunca ortalama %50 oranında tükenir. Kültürde, bu değer aynı büyüme sistemindeki hücre düzeyinde litre başına miligram cinsinden oksijendeki azalmayı zamanla göstermektedir; üç milimetrelik medya yüksekliği boyunca oluşan oksijen gradyanı, medya ile Headspace birleşim noktasında, hücre tabakasına kıyasla neredeyse %50 daha fazladır.

Hücre büyümesi sırasında hypers yığınının trakeal boşluğundaki oksijen yüzdesi gösterilmiştir. Şekil, 96 saat boyunca, her bir gaz geçirgen film tabanını besleyen katmanlar arasındaki oksijen yüzdesinin sabit kaldığını göstermektedir. Bu durum, hücrelerin konfluense ulaşana kadar büyüme sırasında oksijene erişebilme yeteneğini kanıtlamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, kapalı sistemdeki Corning Hypers stack kabının nasıl doldurulacağı ve hasat edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.