Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Bu prosedürde, floresan işaretli RNA transkriptleri XUS oositlerine enjekte edilir ve lokalizasyonları izlenir. İlk olarak, RNA floresan nükleotidler ile işaretlenir.

Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunun ardından RNA, bir mikroenjeksiyon aparatına yüklenir. Oositler bir enjeksiyon kabına yerleştirilir ve dikkatlice mikroenjekte edilir. Son olarak oositler, konfokal mikroskopta görüntüleme yapılmadan önce RNA lokalizasyonunun gerçekleşmesine izin vermek için kültüre edilir.

Merhaba, ben Brown Üniversitesi Moleküler Biyoloji, Hücre Biyolojisi ve Biyokimya Bölümü'nden Dr. Kimberly Mallory'nin laboratuvarından James Gagnan. Bugün size Xap oositlerinde hücre altı RNA lokalizasyonunu görselleştirme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, erken omurgalı gelişimi sırasında RNA lokalizasyonu için gerekli olan RNA mimarisini ve protein faktörlerini incelemek amacıyla bu prosedürü kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde hem radyoaktif hem de floresan işaretli mRNA transkripsiyonunu gerçekleştirin. Kalıp DNA'yı parçalamak için DNase ekleyin ve ardından EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Bir G 50 kolonu üzerinden santrifüj ederek birleşmemiş nükleotidleri ve diğer küçük molekülleri uzaklaştırın. Ardından RNA, etanol çöktürme ile konsantre edilir, yıkanır ve yeniden süspanse edilir. Sintilasyon sayımı ile konsantrasyonu belirledikten sonra, RNA'yı 50 nM konsantrasyonuna seyreltin ve beş µL'lik alikotlar halinde -80 °C'de saklayın.

Mikroenjeksiyonu gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, işaretli RNA'nın bir alikotunu çözün ve 70 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin. Ardından, partikülleri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında bir mikro santrifüjde maksimum hızda 10 dakika santrifüjleyin ve buz üzerinde muhafaza edin. Sonrasında, 25 mL 3 mg/mL içeren 50 mL'lik konik bir tüp içerisine Xenopus laevis yumurtalığından parçalar izole edin.

pH 7.4'de 0.1 molar potasyum fosfat tamponu içindeki kollagenaz. Lotlar arası farklılıklar nedeniyle 18 °C'de nazikçe çalkalayın. Kollagenaz uygulama süresi değişkenlik gösterebilir ve görsel muayene ile dikkatle izlenmelidir.

Defoliasyonun sağlandığından emin olmak için 15 dakika boyunca veya oositler yumurtalıktan gözle görülür şekilde ayrılana kadar çalkalamaya devam edin, ardından oositlerin konik tüpün dibine çökmesini bekleyin. Solüsyonu uzaklaştırın ve yerine MBSH tamponu ekleyin. Bu işlemi tekrarlayın; toplamda üç kez olmak üzere iki kez daha yıkayın.

Ardından, standart bir ışık mikroskobu altında üçüncü veya dördüncü evredeki CYTES'leri ve MBSH tamponunu manuel olarak ayıklayın. Üçüncü evre sitler tamamen opaktır ancak beyazdır. Dördüncü evre sitler ise biraz daha büyüktür ve pigmentle beneklenmiştir.

Hafif şeffaf olan sitler çok genç, tamamen pigmente olmuş veya polarize pigment dağılımı sergileyen sitler ise çok yaşlıdır. Son olarak, üç buçuk inçlik kapilerleri çekerek ve uçlarını eğerek yaklaşık 0,05 milimetre dış çapında iğneler hazırlayıp mikroenjeksiyon için hazır hale getirin. mRNA'lı oositler ve iğneler hazır olduğunda mikroenjeksiyona geçiniz.

Enjeksiyon başına iki nanometre iletmek için iğneyi distile su ile kalibre ederek başlayın. İğneyi gaz kontrollü bir mikroenjektör kullanarak doldurun ve damla boyutunu bir mikrometre yardımıyla kalibre edin; kalibrasyondan sonra enjekte edilecek RNA'yı iğneye ön yükleme yapın. Ardından, ayrıştırılmış oositleri MBSH tamponu içeren, tabanında siyah köpük kauçuk katmanı bulunan bir enjeksiyon kabına yerleştirin.

Beyaz oositler, siyah bir arka plan önünde belirgin şekilde seçilir. Ardından, her bir oositi 50 nanomolar konsantrasyonda iki litrelik RNA ile dikkatlice enjekte edin. Her oositin yalnızca bir kez enjekte edildiğinden emin olun ve enjeksiyon tamamlandığında iğneyi düzenli olarak tıkanıklığa karşı kontrol edin.

Kalan RNA'yı dışarı atın, iğneyi desy suyu ile durulayın ve enjeksiyon için bir sonraki RNA'yı yükleyin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen sitleri steril bir 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın; her kuyucukta bin adede kadar SİT kültüre edilebilir.

Tamponu uzaklaştırın ve her kuyucuğa 400 µL cyte kültür ortamı ekleyin. Ardından, kültür süresince nemli bir ortamı korumak için kültür plağını ıslak bir kağıt havlu bulunan plastik bir kabın içine yerleştirin; oositleri, istenen inkübasyon süresinden sonra sekiz ile 48 saat arasında değişen zaman noktaları için 18 °C'de inkübe edin. Enjekte edilen oositlerin inkübasyonundan sonra oositler mikroskopi için hazırlanabilir.

Ölü oositleri ayıklayın ve hayatta kalan oositleri cam tüplere yerleştirin. Oositlerin %90'ından fazlasının hayatta kaldığı rutin olarak gözlemlenmektedir. Tampon çözeltiyi M-E-M-F-A fiksatif ile değiştirin ve hücreleri 20 dakika boyunca sallayarak inkübe edin.

Fiksasyon süresi tamamlandıktan sonra, fiksasyon sırasında oositleri güneş ışığından koruyun. Fiksatif maddeyi uzaklaştırıp yerine eşit hacimde MBSH tamponu ekleyerek oositleri yıkayın. Toplamda iki yıkama olacak şekilde bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.

Ardından, oositleri susuz metanol ile yıkayın. İlk olarak, hacmin yarısını uzaklaştırın ve yerine metanol ekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.

Bu yıkama işlemlerinin ardından, çözeltinin tamamını uzaklaştırın ve yerine metanol ekleyin. Bu metanol yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Fikse edilmiş veydehidrate edilmiş oositler, görüntüleme aşamasına kadar -20 °C'de saklanabilir.

Görüntüleme öncesinde, görüntüleme yüzeyini kaplamak için cam tabanlı bir WPI fluoro kaba Marie berraklaştırma ortamı ekleyin. Oositleri metanolden fluoro kaba, beraberinde taşınan metanol hacmini minimize ederek dikkatlice aktarın; oositleri ters bir konfokal mikroskopta görüntüleyin, hem Zeiss LSM 510 hem de Aica TCS SP iyi sonuçlar vermektedir. Şimdi, mikroenjeksiyonu takiben gerçekleşen subselüler RNA lokalizasyonuna dair bazı temsili görüntüler göstereceğiz; floresan etiketli kontrolün sekiz saatlik kültürlemesi sonrasında floresan RNA nükleusta görülebilir.

RNA, oosit sitoplazmasında homojen olarak dağılmış halde görülebilir. Ancak, taşıma mekanizmasını aktive eden diziler içeren floresan işaretli bir RNA, oositin vejetal polüne doğru gerçekleşen sübsellüler lokalizasyon sürecinde gözlemlenebilir. Az önce, floresan işaretli RNA'ların zapositlere nasıl mikroenjekte edileceğini ve konfokal mikroskopi ile RNA lokalizasyonunun nasıl izleneceğini gösterdik.

Bu prosedürü uygularken, kültürün RNA kontaminasyonunu önlemek için DEPC ile işlem görmüş solüsyonlar kullanmak, oositlerinizi antibiyotik içeren OCM'de kültüre etmek ve fotobeyazlamayı önlemek için oositlerinizi mümkün olduğunca güneş ışığından korumak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.