Bireysel hazırlanması Drosophila Yumurta Chambers

Aşağıdaki deneyin amacı, canlı drosophila U bölgelerindeki dinamik süreçleri kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle iyi beslenmiş iki günlük dişi sineklerden sağlam yumurtalıkların izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise, yumurta odacıklarını görüntülemek için yumurtalıklardan tekil ariolalar çıkarılır.

Ardından, eğer uygun bir floresan protein eksprese ediyorlarsa, tekil yumurta odacıkları doğrudan görüntülenebilir veya görüntüleme öncesinde floresan markörlerin mikroenjeksiyonu gibi ileri manipülasyonlara tabi tutulabilir. Nihayetinde, film dizilerinin analizi yoluyla, hücre içi bileşenlerin dinamik etkileşimi ortaya çıkarılabilir. Bu yöntem, RNA taşınımı ve lokalize translasyon alanındaki bazı temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olmuştur.

Örneğin, vücut planını oluşturan proteinlerin ekspresyonu, canlı organizmada zaman ve mekan açısından nasıl düzenlenir? Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, yöntem önemli ölçüde hız ve beceri gerektirdiği için zorluk yaşayacaklardır. Her iki durumda da pratik yaparak daha iyi sonuçlar elde edilecektir.

Yumurta odacıklarının manipülasyonlarının metinle aktarılmasının zor olması ve sabırlı bir teknik uzmanlık ile emin ellere ihtiyaç duyulması nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu prosedüre, bir lamel üzerine küçük bir damla halokarbon yağı damlatıp kenara ayırarak başlayın. Ardından, hazırlanan sinekleri karbondioksit ile anestezi altına alın.

Şişman bir dişi sineği abdomenin ön kısmından yakalamak için ince uçlu keskin bir pens kullanın. Abdomen merkezinden yakalamayın. Dişiyi, hazırlanmış lamelin yaklaşık iki ila üç santimetre üzerinde tutun.

İkinci bir pens kullanarak, dişinin en arka kısmındaki dokuyu çıkarın. Bu işlem genellikle temiz penslerle bağırsak dokularını da kapsayacaktır. Karın bölgesini, bir tüpten diş macunu sıkar gibi, ön uçtan arka uca doğru nazikçe masaj yaparak itin.

Yumurtalıklar büyük, opak yapılar gibi görünür ve pensetin ucuna yapışacaktır. Yumurtalıkları, lam üzerindeki halo karbon yağına dokundurarak toplayın. Ardından, dört ila altı yumurtalık toplayana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Hava organlarını izole etmeden önce mikroskoptaki ışık kaynağını, aydınlatmanın lama sığ bir açıyla vurmasını ve dokular üzerinde kontrast gölgeler oluşturmasını sağlayacak şekilde ayarlayın. Sinekleri diseke ederken doğru aletleri kullanmak çok önemlidir.

Kullandığımız işaretleyici, dokuya zarar vermemesi için çok keskin değil, ancak kullandığımız cımbızları kavrayabilmemiz için yeterince kütle sahiptir. Yine, dokulara zarar vermeyecek kadar keskin olmayan ancak aleti bükmeden manipülasyon yapabilmemiz için yeterli olan bir uç yapısına sahiptir. Ayrıca, aletlerin temiz olması çok önemlidir, bu nedenle prosedür boyunca kapalı penset kullanarak onları düzenli olarak temizliyoruz.

Arka uçtaki bağ dokusunu uzaklaştırarak iki ovaryumu birbirinden ayırın. Arka uç, en olgun yumurta odacıklarına sahiptir. Bir ovaryumu, en genç yumurta odacıkları baskın elinize bakacak şekilde yatay olarak konumlandırın.

Ardından, posterior ucu kalan bağ dokusundan nazikçe kavrayın ve tek tek egg chamber'ları ayırmak için bir diseksiyon probu veya tungsten iğne kullanın; Jamar aşamasından 10. aşamaya kadar olan egg chamber'lar birbirinden ayrılacaktır, ancak daha yaşlı egg chamber'lar ovaryuma tutunmuş halde kalacaktır. Prob ile, ayrılan 15 ila 25 egg chamber'ı dikkatlice yağ damlasının merkezine sürükleyin. Birden fazla ovaryumun disseke edilmesi gerekiyorsa, farklı bir sinekten bir tane seçin.

Fazla yumurtalık dokusunu atın ve hızlı çalışın, çünkü sitler stres nedeniyle fenotipik değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Yumurtalıktan diseke edildikten 40 dakika sonra, fazla yumurtalık dokusunu yağdan çıkarın. Orta evre sitlerin enjeksiyonu için temiz aletler kullanarak, aerialleri lamelin uzun eksenine dik şekilde konumlandırın. Geç evre yumurta odacıklarını izole etmek için.

Daha önce açıklandığı üzere, yumurtalığın posterior kısmının tutulmasıyla farklı bir yöntem gereklidir. Diseksiyon probunu, forsepslerin yakınındaki yumurtalığın posterior ucundan içeri yerleştirin. Yumurta odacıklarını delmemek için, probu geç evreli yumurta odacıklarının arasına yerleştirin.

Diseksiyon iğnesini, erken evre yumurta odacıklarından çıkana kadar overin içinden geçirin. Doğru yapıldığında, prob, aerialleri ve geç evre yumurta odacıklarını yerinde tutan bağ dokusunu temizleyecektir. Aerialler lam üzerinde yayılana kadar bu adımı tekrarlayın.

Yumurta odacıkları artık üst üste istiflenmediğinde, bu adım tamamlanmış demektir. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için bir diseksiyon probu kullanarak geç evre yumurta odacıklarını birbirinden ayırın; Evre 14 boyun odacıklarını konumlandırmak için dorsal eklerini tutmak üzere penset kullanın.

Enjekte edilecek solüsyonları, yüksek hızda kısa süreli santrifüj ederek hazırlayın. Bu işlem, enjeksiyon iğnesini tıkayabilecek katı çökmeleri pellete dönüştürecektir. Ardından, bir yükleme ucuyla enjeksiyon iğnesini doldurun ve yüklü enjeksiyon iğnesini dikkatlice enjektöre takın.

Şimdi küçük bir cam parçasını numunelerin yanına yerleştirin ve lamı mikroskop tablasına monte edin. Cam, kırılmayı veya açılmayı önlemek için bir duvar görevi görecektir. İğneyi çıkarın.

Mikroskobu ve enjeksiyon düzeneğini deney için hazırlayın. İğne ucunu kırmamaya dikkat edin. Mümkünse, enjeksiyon yapılacak tüm sekizinci ve dokuzuncu evre sitlerini işaretlemek için nokta ziyaret kapasitesine sahip otomatik bir tabla kullanın.

Şimdi, enjeksiyon iğnesini yağa değene kadar indirin. İşaretli noktalar listesinden ilk noktayı seçin ve hücreye odaklanın. İğneyi, hücre ile aynı odak düzlemine gelene kadar manuel olarak indirin.

Manipülatör kontrollerini kullanarak, enjeksiyon iğnesinin ucunu U bölgesinin içine girene kadar hareket ettirin. Hızlı bir saplama hareketi genellikle yavaş bir hareketten daha başarılı olur. İğne içeri girdikten sonra, küçük bir hacimde sıvı boşaltın ve etkileri görsel olarak değerlendirin.

Tekrar gereklidir. Enjeksiyon başarılı olursa, hücrenin içindeki sitoplazma yer değiştirmiş olacaktır. Enjekte edilen sıvı miktarının kesin olarak belirlenmesi zordur.

Enjekte edilen hacmi artırmak için ya basıncı ya da enjeksiyon impuls süresini ayarlayın. İğne açıklığını hafifçe artırmak için iğne ucunu kırın veya bir sonraki mark.Cyte'ı seçmeden önce sadece birden fazla enjeksiyon impulsu uygulayın. Enjeksiyon iğnesini, diğer sitlelere çarpmayacak şekilde yağ içerisinde yeterince yükseğe kaldırın.

İğneyle sit içerisinde aşırı batırma veya bekleme, yumurta odasına ciddi şekilde zarar verir. Bu nedenle hızlı olun. Enjeksiyon 10 saniyeden daha kısa sürmelidir.

Bir hata yapıldığında, bir sonraki işaretleme alanına geçin. Hasarlı bölgelerde zaman kaybetmeyin. İğne tıkandığında, iğneyi kırık cam parçasına götürün.

Cam ve iğne aynı odak düzlemindeyken, iğneyi nazikçe camın içine itin. Enjeksiyon düğmesine basarak iğnenin ucundan sıvı çıkıp çıkmadığını kontrol edin ve iğnenin tıkalı olmadığını test edin. Tüm US bölgeleri enjekte edildiğinde, iğneyi manuel olarak yağdan çıkarın ve mikroskobun ışın yolunun dışına yönlendirin.

Göz hasarını önlemek için güvenli bir yönlendirmede olduğundan ve ışıkların kapalı olduğundan emin olun. Floresan görüntüleme işlemini kolaylaştırmak için hız büyük önem taşır. Yumurta odacığı izolasyonu ile sit enjeksiyonu arasında bir saat veya daha fazla süre geçtiyse, sitlerin enjekte edilmesi zorlaşacak ve stresle ilişkili fenotipik değişiklikler görülecektir.

Cyte'un kaba taşınması veya aşırı hacimlerin enjeksiyonu ile benzer sorunlar ortaya çıkabilir. Trenchgenic floresan proteinler eksprese eden yumurta odacıkları, enjeksiyona gerek kalmadan görüntülebilir. Endojen RNA'nın MS iki etiketlemesi, in vitro sentezlenen tam prosedürün kullanıldığı doku izolasyon prosedürleri ile iyi sonuçlarla görüntülenebilir.

Alexa 546 işaretli RNA, bir ME 31 BGFP yumurta odasına enjekte edildiğinde, RNA sitoplazmanın dorsal anterior bölgesinde lokalize olmuş ve çekirdeğin etrafında bir kap oluşturmuştur. Uzmanlaşıldığında, bu teknik diseksiyondan görüntüleme başlangıcına kadar yaklaşık 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, hızlı ancak dikkatli çalışarak dokuyu korumaya özen gösterin. Bu videoyu izledikten sonra, canlı Drosophila sitoplazmalarındaki dinamik süreçlerin nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.