Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bitki hücre duvarlarının lignin içeriğinin ve bileşiminin belirlenmesi, çeşitli ekstraksiyon işlemlerine tabi tutulan kurutulmuş bitki materyali ile başlar. Elde edilen materyal sadece hücre duvarlarından oluşur ve ardından lignin içeriğini belirlemek için ayrıştırılır. Duvar materyali asetil bromür ile hidrolize edilir ve lignin bileşiminin belirlenmesi için çözünür hale gelen monomerler UV spektrometrisi ile nicelleştirilir.

Duvar materyali sitoliz yoluyla hidrolize edilir. Çözünür hale gelen lignin bileşenleri daha sonra, gaz kromatografisinin kütle spektrometrisi ile birlikte kullanımıyla ayrıştırılabilecek ve miktarları belirlenebilecek uçucu trimetil silil türevlerine dönüştürülür. Matris polisakkarit kompozisyonunun ve selüloz içeriğinin belirlenmesi, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Kompozisyon Analizi, İkinci Bölüm Karbonhidratlar başlıklı başka bir videoda gösterilmektedir.

Merhaba, ben Marcus Pauley, Michigan State Üniversitesi'ndeki Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'nde bulunan Duvar Analitik tesisinin sorumlusuyum. Ben de Cliff Foster, analitik hücre duvarı tesisi yöneticisiyim. Size bitki biyokütle örneklerinin içeriğinin ve bileşiminin nasıl belirleneceğine dair prosedürü göstereceğiz.

Bitkiler, güneşten gelen ışık enerjisini biyokütle gibi kimyasal enerjiye dönüştürürler. Bitki biyokütlesi, esas olarak tüm bitki hücrelerini çevreleyen çeşitli polimerlerin karmaşık bir ağı olan hücre duvarlarından oluşur. Burada, oldukça bol bulunan yenilenebilir bir kaynak olan bu lignin Cellose X bileşenlerini biyoyakıtlara dönüştürme potansiyelini değerlendirmek için bitki hücre duvarı materyallerinin bileşimini belirliyoruz.

Bugün, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Kompozisyon Analizi, ikinci bölüm karbonhidratlar başlıklı başka bir videoda polifenolik lignin konusuna odaklanacağız. Polisakkarit analizine yoğunlaşacağız. Bu prosedüre başlamak için, iki mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe üç adet 5,5 milimetre paslanmaz çelik bilye ve yaklaşık 60 ila 70 miligram havada veya dondurarak kurutulmuş bitki materyali ekleyin.

Materyal, bir öğütme ve dağıtma robotu olan eyewall kullanılarak ince bir toz haline getirilebilir. eyewall tüpü alır ve 30 saniye boyunca sallar; buradaki metal bilyalar sayesinde materyal ince bir toz haline gelir, ardından öğütülmüş ancak sıkışmış bitki tozu alternatif, robotik olmayan, düşük kapasiteli bir prosedürle gevşetilir. Bir retro işlemini kolaylaştırma ikinci bölümde sunulmuştur; öğütülmüş materyale 1.5 M %70 sulu etanol ekleyin, iyice vorteksleyin ve oda sıcaklığında santrifüjleyin.

Bu işlem çoğu proteini ve hücre organelini çözer; süpernatantı aspire edin ve hacimce bire bir oranında kloroform metanol çözeltisi ekleyin. Alkolde çözünmeyen peleti iyice çalkalayın, peleti yeniden toplamak için santrifüjleyin. Kloroform metanol, lipidler gibi hidrofobik bileşikleri ekstrakte eder; santrifüjden sonra süpernatantı aspire edin ve peleti 500 µL aseton içerisinde yeniden süspande edin.

Numuneyi kurutmak için, solventi 35 °C'de bir hava akımı ile kuruyana kadar uçurun; kurutulmuş numuneler daha sonraki işlemler için oda sıcaklığında saklanabilir. Numune kalıntılarından nişastanın uzaklaştırılmasını başlatmak için, peleti ve 1.5 mL 0.1 M sodyum asetat (pH 5) süspansiyon haline getirin, tüpleri kapatın ve nişastayı jelatinize etmek için bir ısıtma bloğunda ısıtın. Süspansiyonu buz üzerinde soğuttuktan sonra, nişasta parçalayıcı enzim karışımını ekleyin, tüpü kapatın ve vorteksleyerek iyice karıştırın; süspansiyonu gece boyunca inkübe edin.

37 °C'deki çalkalayıcıda, bir rotasyonel çalkalayıcı uygun karışımı sağlar. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, sindirimi 100 °C'deki bir ısıtma bloğunda 10 dakika ısıtarak sonlandırın. Ardından santrifüj yapın ve çözünmüş nişasta içeren süpernatanı atın.

Kalan peleti, daha önce gösterildiği gibi vorteksleyerek, santrifüjleyerek ve dekante ederek, her seferinde 1,5 ml su kullanarak üç kez yıkayın. Son olarak, peleti 500 microliter aseton içinde yeniden süspande edin ve çözücüyü 35 °C'de bir hava akımıyla kuruyana kadar uçurun. İzole edilmiş hücre duvarı veya bacak, selülöz içermeyen kurutulmuş numuneler ileri analizler için hazırdır ve oda sıcaklığında saklanabilir.

Hazırlanmış hücre duvarı materyalinden 1 ila 1,5 miligram tartarak başlayın. Materyal, ikinci bölümde gösterildiği gibi, manuel olarak veya eye wall kullanılarak otomatik bir şekilde tartılabilir. Hücre duvarı materyalini tüpün dibinde toplamak için tüp duvarlarını 250 µL aseton ile durulayın ve asetonu hava akışı altında çok nazikçe uçurun.

Aseton uçtuktan sonra, taze hazırlanmış hacimce %25'lik glasiyal asetik asit içindeki asetil bromürden 100 µL'yi iki duvar boyunca yavaşça ekleyin. Sıçramayı önlemek için uygulanan bu hafif bromür işlemi, lignin polimerini asetillenmiş monosakkaritlerine parçalar. Ardından, balon jojeyi kapatın ve iki saat boyunca 50 °C'de ısıtın.

Her 15 dakikada bir dört kez çalkalayarak bir saat daha ısıtın ve son olarak buz üzerinde soğutun. Balonu oda sıcaklığında soğuttuktan sonra, 400 µL 2 M sodyum hidroksit ve taze hazırlanmış 0,5 M hidroksilamin hidroklorürden 70 µL ekleyin ve balon jojeleri vortekslleyin. Ardından, balon jojesini glasiyal asetik asit ile tam olarak 2 mL çizgisine kadar doldurarak çözeltiyi nötralize edin, kapağını kapatın ve karıştırmak için birkaç kez ters yüz edin. Hidrolize edilmiş ve çözünür hale getirilmiş monoasil glikanları içeren çözeltiden 200 µL'yi UV spesifik 96 kuyucuklu bir plakaya pipetleyin ve plakayı bir plaka okuyucuda 280 nm'de okuyun. Partiküller absorbans değerlerinde hafif varyasyonlara neden olabileceğinden, plakayı en az üç kez okuyun ve absorbans değerlerinin ortalamasını alın.

Yazılı protokolde sunulan formül ve uygun bitki katsayısı kullanılarak, eser bromür çözünür lignin veya A BSL yüzdesi belirlenir. Lignin; temel olarak p-hidroksifenil, guaiacyl ve syringyl alt birimlerinden oluşan bir polifenol ağıdır ve bitki materyalindeki lignin kompozisyonunun belirlenmesi gerekir. İşleme, yaklaşık 2 mg hücre duvarı materyalini sitoliz için vidalı kapaklı bir cam tüpe aktararak başlayın.

Ardından, %2,5 boron triflorür etilat ve %10 etan tiyol dioksan çözeltilerini hazırlamaya başlayın. Dioksan çok tehlikeli olduğundan, hiçbir numuneyi veya ekipmanı çeker ocaktan dışarı çıkarmayın. Çok dikkatli çalışmayı unutmayın ve dioksan şişesindeki kayıp hacmi azotla doldurmak için azot gazı dolu bir balon kullanın.

Örnek başına 175 µL dioksan, 20 µL ETSH ve 5 µL BF3 hacimlerini karıştırarak çözeltiyi hazırlayın. Karıştırma işleminden sonra, her örneğe 200 µL çözelti ekleyin. Flakonun boşluk kısmını azot gazı ile süpürün ve kapağını kapatın.

Numuneleri, her saat sonunda hafifçe karıştırarak 100 °C'de dört saat boyunca ısıtma işlemine hemen geçin. Lizis reaksiyonunu beş dakika boyunca buz üzerinde durdurun. Ardından, nötralize etmek için 150 µL 0,4 M sodyum bikarbonat ekleyin ve vorteksleyin.

Lignin yıkım ürünlerinin temizlenmesi için, 1 mL su ve 0,5 mL asetat ekleyip vortekslenmiş numuneyi fazlar ayrılana kadar bekletin. Etil asetat tabakası üstte, su ise altta yer alacaktır. Lignin bileşenlerini içeren üst etil asetat tabakasından 150 µL'yi, su transfer edilmediğinden emin olarak 2 mL'lik bir tüpe aktarın.

Üstteki etil asetat katmanının transferinden sonra, çözücüyü hava akışlı bir konsantratör kullanarak uçurun. 200 µL aseton ekleyin ve uçurun. Fazla suyu uzaklaştırmak için asetonla işlemi iki kez tekrarlayın.

Lignin bileşenlerini uçucu trimetilsilil türevlerine dönüştürmek için her tüpe 500 µL etil asetat, 20 µL piridin ve 100 µL N,O-bis(trimetilsilil)asetamid ekleyin. 25 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

İki saatin sonunda, reaksiyondan 100 µL'yi bir GC-MS şişesine aktarın ve 100 µL aseton ekleyin. Numuneleri, kuadrupol kütle spektrometresi veya alev iyonizasyon dedektörü ile donatılmış bir GC ile analiz edin. Kolon ve çalışma detayları için lütfen ekteki yazılı protokole bakın.

Bitkisel materyal olarak kavak odunu kullanılarak yapılan lignin analizinin bazı temsili sonuçları burada sunulmuştur. Bu analize göre, kavak materyalinin %22'si polifenolik ligninden oluşmaktadır. Lignin bileşenlerinin kompozisyonu GCMS ile analiz edilmiştir.

Pikler, tetra koan iç standardı kullanılarak göreceli tutunma zamanları ile veya sırasıyla sg ve h monomerleri için karakteristik kütle spektrumu ikonları olan 2 99 MZ, 2 69 MZ ve 2 39 MZ aracılığıyla tanımlanır. Lignin bileşenlerinin kompozisyonu, toplam pik alanı %100 olarak belirlenerek nicelendirilmiştir. Kompozisyon analizi, bu özel örneğin temel olarak siringil veya S birimleri içerdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, guaiasil, alkil-fenolik veya G birimleri de bol miktarda bulunmaktadır.

Açıkça görülmektedir ki, miktar ve monolitik birim kompozisyonu bitki dokusuna ve türüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Polisakkaritlerin analizi için bitki materyalinin lignin içeriğinin ve kompozisyonunun nasıl belirleneceğini size göstermiş olduk. İkinci bölüme geçiniz.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.