Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Bitki hücre duvarlarının matriks polisakkarit bileşiminin ve kristal selüloz içeriğinin belirlenmesi, çeşitli ekstraksiyon işlemlerine tabi tutulan kurutulmuş bitki materyali ile başlar. Elde edilen materyal yalnızca hücre duvarlarından oluşur ve ardından matriks polisakkarit bileşimini belirlemek için parçalara ayrılır. Duvar materyali, temel olarak hemiselülozlar olan kristal olmayan polisakkaritleri monosakkaritlerine hidroliz etmek için zayıf bir asit ile işleme tabi tutulur.

Monosakkaritler daha sonra ilgili uçucu aldol asetatlarına türevlendirilir ve ardından kristal selülozun belirlenmesi için kütle spektrometresine bağlı gaz kromatografisi ile analiz edilip miktarları belirlenir. Hücre duvarları, kristal olmayan duvar bileşenlerini uzaklaştıran asit karışımı olan grafik reaktifi ile işlenir. Geriye kalan kristal selüloz, kolorimetrik olarak analiz edilebilen monomer glikoza parçalanır.

Lignin içeriğinin ve bileşiminin belirlenmesi, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşim Analizi, Birinci Bölüm Lignin başlıklı başka bir J video yayınında gösterilmektedir. Merhaba, ben Marcus Pauley, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Great Lakes Bioenergy Research Center'daki Duvar Analitik Tesisinin sorumlusuyum. Ben de Hücre Duvarı Analitik Tesisi yöneticisi Cliff Foster.

Bugün, çeşitli hücreli materyallerdeki selüloz içeren bitki hücre duvarı materyalinde bulunan polisakkaritlerin bileşiminin nasıl belirleneceğini göstereceğiz. Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'nde, bu şekerleri biyoyakıtlara dönüştürecek teknolojiler geliştiriyoruz. Optimal bir bitki ham maddesini belirlemek için öncelikle bu biyokütlede bulunan şekerlerin türünü ve miktarını değerlendirmemiz gerekmektedir.

Bitki Hücre Çeperlerinin Kapsamlı Kompozisyonel Analizi, birinci bölüm Lignin başlıklı diğer bir videoda, polifenol analizine odaklanacağız. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre hücre çeperlerini izole ederek başlayın.

Yaklaşık 60 ila 70 miligram kurutulmuş bitki materyalini, iki mil SAR TED vidalı kapaklı tüp içinde 5,5 milimetre paslanmaz çelik bilyalarla öğütün. Yüksek kapasiteli bir alternatif olarak REM değirmen kullanırken, birinci bölümde açıklandığı üzere eyewall olarak adlandırılan bir öğütme ve dağıtma robotu kullanın. Öğütme işlemi tamamlandığında, çelik bilyaları çıkarın.

Birinci bölümde gösterildiği ve beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı gibi hücre duvarlarını izole etmeye ve kalıntı nişastayı uzaklaştırmaya devam edin. İki miligram DS nişasta hücre duvarı materyalini iki mililitrelik sared tüpüne tartın. Bu görevi gerçekleştirmenin yüksek kapasiteli bir yolu eyewall robotudur.

Robot, öğütülmüş bitki materyali içeren bir tüpü alır ve tüpün altına bir delik açar. Delinen tüp daha sonra bir VI besleyiciye yerleştirilir. Boş bir tüp terazi üzerine yerleştirilir ve titreşim yoluyla VI besleyicinin altına kaydırılır; materyal, istenen miktar birikene kadar üstteki dolu tüpteki delikten süzülerek alttaki boş tüpe akar.

İç standart olarak 100 micrograms aseto ekleyin. Hücre duvarı materyalini tüpün dibinde toplamak için tüp duvarlarını asetonla durulayın ve asetonu hava akışı altında çok nazikçe uçurun. Ardından, zayıf asit hidrolizi gerçekleştirin.

Her bir örneğe, tüp duvarlarına herhangi bir materyalin sıçramadığından emin olarak dikkatle 250 µL iki molar trikloroasetik asit veya TFA ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve bir ısıtma bloğunda 121 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Ardından ısıtma bloklarını ve örnekleri buz üzerinde soğutun ve tüpleri 10.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Matris polisakaritinin çözünürleştirilmiş şekerlerini içeren asidik süpernatantın 100 microliters kısmını, pelet materyalini rahatsız etmemeye dikkat ederek vidalı kapaklı viallere aktarın. Pelet, kristalin selüloz analizi için kullanılabilir. TFA'yı, bir evaporasyon cihazında, hafif bir hava akımı altında cam tüp içinde evaporate edin.

Fazla asidi uzaklaştırmak için 300 µL iki propanol ekleyin, vorteksleyin ve 25 °C'de buharlaştırın. Bu işlemi toplamda üç kez tekrarlayın. Monosakkaritlerin gaz kromatografisi ile tanımlanmasını sağlamak için aldol asetat türevlendirmesi gerçekleştirin.

İlk olarak, monosakkaritleri karşılık gelen açık halkalı aldollerine indirgeyin ve ardından bunları asetilleştirin. Detaylı talimatlar için ekteki yazılı protokole başvurun. Prosedürün her bir adımı; reaktif ekleme, inkübasyon, bir hava akımı altında buharlaştırma ve ardından çeşitli yıkama basamaklarıyla fazla reaktifin uzaklaştırılması şeklinde önceden gösterilen protokolü takip eder.

Son aşamalarda, aldol asetatlar ekstre edilir. İlk olarak, 500 µL etil asetat ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Ardından iki mL su ekleyin, tüplerin kapağını kapatın ve vorteksleyin; tüpleri 2000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek, üstte aldol asetatları içeren etil asetat tabakasının ve altta su tabakasının bulunduğu net ayrışmış katmanlar elde edin. Etil asetat tabakasından 50 µL'yi insertli GC-MS viallerine pipetleyin; GC vialine 100 µL aseton ekleyerek seyreltin. Hazırlanan GC vialleri 4 °C'de saklanabilir.

GC-MS analizi hemen gerçekleştirilmeyecekse, örnekleri kuadrupol kütle spektrometresi ile donatılmış bir gaz kromatografına enjekte edin. Kolon ve çalışma detayları için lütfen beraberindeki yazılı protokole başvurun. Kristalin selüloz içeriğinin belirlenmesi için başlangıç materyali olarak, izole edilmiş hücre duvarı materyali veya zayıf asit TFA ile önceden işlem görmüş duvar materyali (asit işleminden hemen sonra veya saklanabilir kurutulmuş formda) kullanılabilir.

Daha önce gösterildiği gibi izopropanol ile fazla TFA uzaklaştırıldıktan sonra, iki M sars tüplerindeki TFA peletine; asetik asit, nitrik asit ve sudan oluşan bir M up degra reaktifini sekize bire veya ikiye bir hacim/hacim oranında ekleyin. Tüpün kapağını sıkıca kapatın, vorteksleyin ve bir ısıtma bloğunda 100 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Bu işlemin sonucunda, pelette yalnızca kristalize selüloz kalır.

Diğer tüm polisakkaritler hidrolize edilir; blok üzerindeki numuneler buz üzerinde oda sıcaklığına veya daha düşük bir sıcaklığa kadar soğutulur. Ardından numuneler 10, 000 RPM hızında 15 dakika boyunca santrifüj edilir; santrifüjleme işleminden sonra, peletin bozulmadığından ve peletten herhangi bir materyalin uzaklaştırılmadığından emin olarak süpernatan uzaklaştırılır. Bu amaçla, tüpte yaklaşık 150 microliters süpernatan bırakılır ve pelet su ile birkaç kez yıkanır.

Ardından, kristali ve selüloz peletini tamamen glikoza hidrolize etmek için konsantre sülfürik asit ile bir hidroliz işlemi gerçekleştirin. Sarta tüpüne 175 µL %72 sülfürik asit ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İlk inkübasyonun ardından, numuneyi vorteksleyin ve 15 dakika daha inkübe edin.

Ardından 825 µL su ekleyin, vortexleyin ve örnekleri 10.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Glikoz süpernatantta yer alırken, tüpte çoğunlukla ligninden oluşan bazı kahverengi ve çözünür maddeler kalmış olabilir. Süpernatantın glikoz içeriği, Kolorimetrik anton assay yöntemiyle analiz edilir.

Bu analiz, 96 kuyucuklu polistiren bir mikrotiter plakada gerçekleştirilir. Ekli yazılı protokoldeki talimatları izleyerek glikoz standart eğrisini dubleks olarak hazırlayın. Her bir örnekten 10 µL süpernatan ve 90 µL suyu, standartlarla aynı mikrotiter plakanın ayrı kuyucuklarına ekleyerek örnekleri hazırlayın; ardından 200 µL taze hazırlanmış reaktif ekleyerek işlemi tamamlayın.

Ardından, plakayı alüminyum bir ısı dağıtıcı ile birlikte fırında 80 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Isıtma işlemi tamamlandığında, glikoz içeren örneklerin sarıdan mavi-yeşile döndüğünü gözlemleyin. Plakanın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve iyice çalkalayın.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 625 nanometredeki absorbansı ölçün. Selülozun yapı taşı olan glukoz içeriği, aynı plaka üzerinde oluşturulan standart eğri ile karşılaştırılan absorbansa göre hesaplanır. Burada, bir kavak ağacı parçasının polisakkarit analizine ait bazı temsili sonuçlar yer almaktadır.

Gaz kromatogramı pikleri, kütle profilleri ve/veya standartların alıkonma süreleri ile tanımlanır. Monosakkaritler, standart eğrilere göre kantifiye edilir. Matris polisakkaritlerinin şeker analizi, hemiselülozu temsil eden yüksek miktarda ksiloz olduğunu göstermektedir, ancak diğer şekerler de mevcuttur.

Analize göre, kavak materyalinin %40'ı kristal ve selülozdan oluşmaktadır. Bu içeriklerin ve bileşimlerin bitkiden bitkiye veya farklı bitki anatomileri arasında değişiklik gösterebileceğini lütfen unutmayın. Polifenol ligninin analizi için lignoselülozik biyokütlenin polisakkarit içeriğinin nasıl belirleneceğini ve bileşim analizinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.

Birinci bölüme göz atın. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.