Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu video makalesinin genel amacı, şu iki soruya yanıt vermektir. Birincisi, bir protein örneğinin başka bir proteine bağlanma kapasitesine sahip olan kısmının ölçülmesiyle, protein etkileşimleri çalışmaları daha güvenilir hale getirilebilir mi? İkincisi, kinetik analizler yapı-fonksiyon ilişkilerini daha iyi anlamamıza nasıl yardımcı olabilir?

Bu soruların her ikisi de, etiket kullanmadan protein etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak tespit eden bir cihaz olan Corp X 100'ün kullanıldığı bir deneyle ele alınacaktır. Bu deneyde, sığır cystatin B ile cystine proteaz papain etkileşimi incelenecektir; iki proteinin kompleks halindeki kristal yapısı, proteaza bağlanmada rol oynayan birkaç kalıntığa işaret etmektedir ve böylece etkileşime giren her bir kalıntının cystatin B-papain etkileşimini nasıl etkilediği belirlenecektir. Bölgeye özgü mutagenez (site-directed mutagenesis) yoluyla çeşitli cystatin B varyantları üretilir.

Bu tür deneylerde, rekombinant proteinlerin doğru şekilde katlanmaması, agregasyon oluşturması veya bozulması sonucu hatalı ve tekrarlanamaz sonuçların ortaya çıkma olasılığı her zaman vardır. VIACORE X 100, CFCA (kalibrasyonsuz konsantrasyon analizi) olarak kısaltılan yöntemle, bağlanma için uygun olan protein fraksiyonunun belirlenmesi yeteneğine sahiptir. Bu yaklaşım, kalibrasyon standartları mevcut olmadığında bile bağlanma aktivitesini koruyan protein konsantrasyonunun belirlenmesine olanak tanır.

Kistatin B varyantlarının konsantrasyonunu belirlemek için burada CFCA kullanılacaktır. Bu veriler daha sonra, yine BOR X 100 kullanılarak değerlendirilen kistatin B varyantlarının Pepin'e bağlanma kinetiğinin belirlenmesinde girdi olarak kullanılacaktır. Merhaba, ben İsveç'teki GE Healthcare'den CLA gram.

Bugün meslektaşım Eva Pool, BOR X 100 kullanarak yapı-fonksiyon ilişkisi analizinin nasıl yapılacağını size gösterecek. Rekombinant proteinler zamanla hatalı katlanma gösterebilir veya bağlanma aktivitesini kaybedebilir ve bu davranış, toplam konsantrasyon ölçümüne dayanan yöntemlerle tespit edilemez. Bu durum, kalibrasyonsuz konsantrasyon analizi ile yapılan konsantrasyon ölçümlerini takiben yanlış kinetik verilere yol açabilir. B.A core X 100, sistatin B varyantlarının pepsinle etkileşiminin kinetiğini ve afinitesini analiz etmek için kullanılır.

Bu parametreler, bağlanma mekanizmasına dair bir içgörü sağlayacaktır. Deney tasarımının kısa bir açıklamasıyla başlayalım, hadi başlayalım. İki proteinin kompleks halindeki kristal yapısından anlaşıldığı üzere, sistin proteaz papain ile inhibitör sistatin B arasındaki etkileşimde hidrofobik temaslar baskındır.

İnhibitör tarafında temas alanları N ve C terminal bölgeleri ile iki saç tokası benzeri döngüdür (hairpin loops). Bu çalışmada, her biri cystatin B'nin dimerleşmesini önlemek amacıyla sistein mutasyonları içeren dört mutant incelenmiştir. Kristal yapıda ortaya çıkan bağlama göre, lösin 73 glisine, histidin 75 glisine ve tirozin 97 alanine mutasyona uğratılmıştır. İki glisin mutasyonu, histidin 75 ve lösin 73 yan zincirlerinin Pepsin'e bağlanmadaki önemini incelemek için yapılmış; tirozin kalıntısı ise cystatin B'nin C terminusi ile Pepsin arasındaki etkileşimi araştırmak amacıyla alanine mutasyona uğratılmıştır.

Üç çift mutantın yanı sıra INE üçten Suriye tek mutantı, Papain S metil popinin katalitik olarak inaktif bir varyantı ile olan etkileşimleri açısından test edilir. Proteazın bu katalitik olarak inaktif formu, aktif yarıktaki CYS 25'e bağlı bir metil grubuna sahiptir. Basitlik adına, protokol boyunca bu varyantı propan olarak adlandıracağız.

CFCA, bağlanma hızının, analit moleküllerinin yüzeye difüzyonu ile sınırlı olduğu koşullar altındaki ölçümüne dayanır. Bu durum, ligandın yüksek immobilizasyon seviyeleri ile desteklenir. Immobilizasyon prosedürüne başlamadan önce, deneylerde kullanılan HEPs tamponu sol taraftaki tepsiye yerleştirin ve her iki boruyu da takın.

Ayrıca sağ taraftaki tepsiye boş bir atık şişesi yerleştirin. Ardından, cihaza yeni bir sensor gypsum five yerleştirin, core X 100 yazılımı aracılığıyla başlatma işlemini gerçekleştirin ve başlangıç ekranında dock chip tool öğesine tıklayın. Yazılımdaki start doc seçeneğine tıklayın.

Ardından, başlangıç ekranından "coupling to censorship CM five" hedefli bağlama ve immobilizasyonu ayarlamak için immobilizasyon sihirbazını kullanın; diğer seçenekler butonuna tıklayın, ardından sihirbazları seçin. Bu işlem, mevcut sihirbazların olduğu bir pencere açar. Immobilizasyon'u seçin ve ardından sağ alt köşedeki yeni butonuna tıklayın; immobilizasyon sihirbazının ilk ekranı görünecektir, "coupling to sensor gypsum five" hedefli bağlama varsayılan olarak seçilidir.

Akış hücresi ikisine sabitlemek için akış hücresi iki'nin altındaki kutucuğu işaretleyin. Aşağıdaki üç mevcut seçeneği kullanarak referans yüzey olarak kullanmak amacıyla akış hücresi bir modifiye edilmeden bırakılır. Sağdaki hedef seviye "contact time" (temas süresi) olarak değiştiğinde "specify contact time" (temas süresini belirtin) kutucuğunu işaretleyin ve 900 saniyelik bir temas süresi belirtin.

Ardından, yakalama molekülü/ligand çözeltisi kısmına immobilizasyon parametrelerini girin. Papain yazın. Daha sonra sonraki butonuna tıklayın.

Bir sonraki ekran, numune rafının düzenini gösterir. Birinci konum, ligand papainin çip yüzeyine bağlanmasının ardından kalan aktif bölgeleri etkisiz hale getirmek için kullanılan etanolamin için ayrılmıştır. Etanolamin çözeltisini birinci konuma ve ikinci konuma yerleştirin.

Ligand olan papain, fazla miktarda metil sülfat içinde saklanır ve 10 milimolar sodyum asetat tamponunda (pH 4.5), mililitrede 50 mikrogram olacak şekilde seyreltilir. Amin bağlama kitindeki EDC ve NHS bağlama reaktiflerini çift distile su ile yeniden çözenle hazırlayın. Bir tüpe 85 mikrolitre EDC pipetleyin. Tüpün kapağını kapatın ve üçüncü pozisyona yerleştirin.

Dördüncü konumdaki NHS için aynı hacmi kullanın. Cihazın ED, C ve NHS'yi bu dosyada karıştırabilmesi için beşinci dosyanın kapalı ve boş olması gerektiğine dikkat edin. Ayrıca, H2O konumundaki yıkama dosyasını taze deiyonize su ile doldurmayı unutmayın.

Raf ekrandaki taslağa göre doldurulduğunda, örnekleri yükle seçeneğine tıklayın ve rafı cihaza yerleştirin. Raf yüklendiğinde, ileriye tıklayın. Çalışma başlatılmadan önce bir kontrol listesi gösterilir.

Maddelerin tamamının karşılandığından emin olun. Çalışma, başlat düğmesine basılarak başlatılır. Çalışma, immobilizasyon prosedürü sırasında başlatılır.

Veriler gerçek zamanlı olarak toplanır. İlk olarak kenetleme reaktifleri enjekte edilir. Ardından pepit chip yüzeyine kenetlenir ve işlem, geri kalan aktif esterlerin deaktivasyonu ile sona erer.

Çalışma tamamlandıktan sonra, bir diyalog penceresi çalışmanın sonucunu özetler. Bu pencerede immobilizasyon seviyesi görüntülenir. Tüm kenetlenme prosedürü, yaklaşık 3000 RU immobilize papain ile sonuçlanmalıdır.

Papain sensör çipine immobilize edildikten sonra, sistatin B mutant örneklerini en az 300 mikrolitre hacimde yaklaşık 10 nanomolar toplam konsantrasyona seyrelterek CFCA analizine başlayın. Seyreltme faktörünü kaydedin çünkü bunu daha sonra analiz kurulumunda kullanacağız. Analiz klasörünün konsantrasyon bölümünde, önceki bölümde açıklandığı gibi sihirbaz diyaloğunu açarak başlayın.

Kalibrasyonsuz (calibration free) seçeneğini, ardından yeni (new) seçeneğini belirleyin. Sihirbazın ilk ekranı enjeksiyon dizisini göstermektedir. Sensör çipi olarak CM five ve doğrudan immobilizasyon analizi yaklaşımı kullanıldığından, ayarlar değiştirilmeden bırakılabilir.

Bir sonraki ekranda "next" seçeneğine tıklayın. "prime before run" ve "run startup cycles" onay kutularını işaretli bırakın. Ayrıca, varsayılan başlangıç döngüsü sayısını üç olarak değiştirilmeden bırakın.

Çözelti adı alanına heaps buffer yazın. Ardından sonraki butonuna tıklayın. Bir sonraki ekranda, rejenerasyon çözeltisinin adı olan 20 millimolar sodyum hidroksiti girin.

Diğer parametreleri değiştirilmeden bırakın. Örnek tablosunu görüntülemek için ilerle düğmesine tıklayın. Örnekları örnek tablosuna göre hazırlayın.

Örnek tablosundaki her satır iki döngü ile sonuçlanır. Biri dakikada 10 µL akış hızında, diğeri ise dakikada 100 µL akış hızındadır. Çalışmaya boş bir örnekle başlayın.

Ardından seyreltme faktörü, 20 °C'deki difüzyon katsayısı ve moleküler ağırlık isimlerini girin. Her mutant için difüzyon katsayısı, ürün web sitesindeki web aracı kullanılarak hesaplanabilir. Bu araca yönelik bir bağlantı, yazılımın destek gezgininde sağlanmıştır.

Her bir numunenin ve kopyasının çalıştırılması önerildiğinden, tablonun tamamını boş satırdan son numuneye kadar kopyalayın ve tablonun altına yapıştırın. Devam etmek için sonraki (next) düğmesine tıklayın. Bir sonraki ekran numune rafını görüntüler.

Numuneleri ve reaktifleri, yazılım tarafından belirtilen düzene göre rafa yerleştirin. Örnekleri yükle düğmesine basarak rafı cihaza yükleyin. Ardından sonraki butonuna tıklayın.

Numuneler yüklendikten sonra, bir kontrol listesi içeren hatırlatma ekranı görüntülenir. Her şeyin kontrol edildiğinden emin olun ve ardından başlat düğmesine basın. Veriler, çalışma sırasında gerçek zamanlı olarak toplanır.

Çalışma tamamlandığında, toplanan verilerin görüntülendiği pencereyi kapatın. Ana pencerede yeni bir sonuç öğesinin belirdiğini gözlemleyin. Verilerden konsantrasyonları hesaplamak için yeni sonuç öğesini seçin ve butona tıklayın.

Core X 100 aracılığıyla değerlendirme yapın. Değerlendirme yazılımı başlatıldığında, araç çubuğundan toplanan tüm veriler görüntülenecektir; konsantrasyon analizini ve ardından menüden kalibrasyonsuz seçeneğini seçin. İlk pencerede, analize dahil edilecek verileri belirleyin.

Tüm örneklere ait verileri görüntülemek için listede kaydırın ve görünüm listesinde ilerleyin. Herhangi bir veriyi hariç tutmak istiyorsanız, listedeki onay işaretini kaldırın. Hesaplamayı başlatmak için ileriyi tıklayın.

Uyumlandırma tamamlandığında, CFCA etkileşim modeli deneysel verilere otomatik olarak uydurulur ve sonuçlar her bir örnek için sonuç penceresinde raporlanır. Tablodaki ilgili satırı seçerek her bir örnek için yapılan uyumlandırmaları sırayla inceleyin. Ölçülen konsantrasyon adlı sütun, analiz edilen örnekteki konsantrasyonu göstermektedir.

Orijinal numunedeki konsantrasyon, daha önce girilen dilüsyon faktörü kullanılarak hesaplanır ve işlem tamamlandığında hesaplanan konsantrasyon sütununda gösterilir; sonucu kaydetmek için bitir'e tıklayın. CFCA analizinden proteinlerin konsantrasyonlarını artık bildiğimize göre, sonraki kinetik ölçümlerimiz için mükemmel bir temele sahibiz. Kinetik analiz, artık temel amino asit kalıntılarının bağlanma mekanizması için önemini anlamamıza yardımcı olacaktır.

Kinetik analiz kurulumuyla başlayalım. Kinetik analiz, başlangıç ekranındaki cihaz içerisine yeni bir CM5 sensör çipinin yerleştirilmesiyle başlar. Kinetik afinite için bir analiz iş akışı oluşturmayı seçin.

Sol üst köşede, ligand ile ilgili bilgilerin girildiği bir diyalog penceresi belirir. Ligand adı kutusuna papain adını girin ve tür listesinden başka bir protein seçin. Ardından, sunulan iki alternatif ligand tutturma yaklaşımından sensor chip CM five kullanarak ligandı kovalent olarak immobilize et seçeneğini belirleyin; önerilen analiz iş akışı şu an pencerenin sağ tarafında özetlenmiştir.

İşlem, bir immobilizasyon adımıyla başlar ve ardından bir analiz adımı gelir. Devam etmek için devam butonuna basın. Bir isim girip kaydet butonuna basarak, istendiği şekilde analiz iş akışını kaydedin.

Yazılım artık her adımla ilişkili düğmelerle analiz iş akışını özetlemektedir. Sensör yüzey hazırlığı altındaki ilk adım, bir mobilizasyon pH'ı belirlemektir. Bu pH değeri bilindiği için, çıkan iletişim kutusunda "bilinen değeri girin" (enter known value) seçeneğine basın.

Tampon adı olarak acetate ve pH 4.5 değerini girin ve kaydet'i seçin. Analiz iş akışı, bu adımın tamamlandığını belirtmek için artık yeşil bir onay işareti ile güncellenmiştir. Şimdi immobilizasyon zamanı, immobilizasyon adımındaki çalıştır düğmesine basın.

Bu işlem, propan ve CFCA analizi immobilizasyonu için kullanılan sihirbazın aynısını açar; kinetik analiz için papinin immobilizasyonu da burada aynı şekilde ayarlanır, ancak daha düşük konsantrasyonlu bir çözelti daha kısa süre boyunca enjekte edilir. Bu, sistatin be mutantlarının bağlanma hızlarının difüzyonla sınırlanması durumlarını önlemek ve böylece kinetik verilerin bağımsız olarak ölçülebilmesini sağlamak amacıyla daha az papin immobilize etmek içindir. Ligand adı ve immobilizasyon pH değeri analiz iş akışının önceki adımlarında girildiği için, bunlar burada önceden tanımlanmıştır.

Tek gerekli güncelleme, temas süresinin 50 saniye olmasıdır. İmmobilizasyon işlemi daha önce gösterildiği şekilde devam eder. İmmobilizasyon sonrası beklenen bağlanma düzeyi 50 R ru'dur.

Çalıştır butonunun yanındaki yeşil onay işareti, immobilizasyonun tamamlandığını gösterir. Ardından, iş akışındaki ilgili adımda rejenerasyon solüsyonunu girin. Açılan diyalog kutusunda bilinen değerleri gir seçeneğine tıklayarak rejenerasyon koşullarını bulun.

Rejenerasyon çözeltisini ve temas süresini girin. Ardından kaydet'e tıklayın. Ligand immobilize edildiğine ve rejenerasyon koşulları girildiğine göre, kinetik veriler üretmek için her şey hazır; run kinetics Affinite analizi kutusundaki run düğmesine basarak kinetikteki ilk adımı başlatın.

Affinity sihirbazı, burada kullanılan tek döngülü kinetik için her döngünün enjeksiyon sırasını özetler; herhangi bir şeyi değiştirmenize gerek yoktur. Devam etmek için "next"e tıklayın. Bir sonraki adımda, çalıştırma öncesinde sistemin hazırlandığını belirten varsayılan ayarları koruyun.

Çip yüzeyini dengelemek için bir başlangıç döngüsü çalıştırmayı seçin. Ardından, örnek için enjeksiyon parametrelerini tanımlayın. Rejenerasyon çözeltisi daha önce belirtildiği ve ayar ön tanımlı olduğu için ekrandaki parametrelerin hiçbirini değiştirmenize gerek yoktur.

Sıradakiye tıklayın. Son olarak, numuneleri belirtin. Her mutant varyant için iki satır girin; birini boş bırakın, diğerine ise numuneyi ekleyin.

En yüksek konsantrasyon parametresi sıfır olarak ayarlanarak boş bir döngü belirtilir. Her çalışmada iki Cystatin B varyantı sığdırılabilir. Her mutant için moleküler ağırlığı, en yüksek konsantrasyonu ve dilüsyon faktörünü girip sonra düğmesine basın.

Sıradaki ekranda, numune rafı belirtilmiştir. Protein numunelerinin bir seyreltme serisini hazırlayın ve kapaklı tüpleri rafa yerleştirin. Ekran üzerindeki belirteçlere uygun olarak, 13. konuma tampon içeren bir tüp ve 14. konuma rejenerasyon çözeltisi içeren bir tüp yerleştirilir. Su konumunun taze suyla doldurulduğundan emin olun.

Rafı makineye yerleştirin, "load samples" butonuna basarak örnekleri yükleyin ve "next" seçeneğine tıklayın. Daha önce olduğu gibi, "start interaction" butonuna basarak deneyi başlatmadan önce son bir kontrol yapın; veriler gerçek zamanlı olarak görünecektir. Çalışma tamamlandığında, az önce gösterildiği şekilde kalan cystatin B varyantlarının çalıştırılmasına hemen geçin.

Kalan sistatin B varyantları art arda çalıştırılacaksa, ilgili adımdaki onay kutularının işaretini kaldırarak hazırlama (prime) adımını ve başlangıç döngüsünü atlayın. Her çalıştırma tamamlandığında, verilere bağlantı üzerinden erişilebilir. Tüm sonuçlar analiz iş akışında yer almaktadır.

Bu iş akışı kapsamında oluşturulan tüm sonuçların bulunduğu bir diyalog penceresi belirir. Kinetik hız sabitlerini hesaplamak için değerlendirilecek sonucu seçin ve evaluate düğmesine basın; core X 100 değerlendirme yazılımı tüm toplanmış verileri görüntüleyerek yeniden başlatılır. Araç çubuğu menüsünden kinetics affinity seçeneğini seçin.

İlk ekranda, değerlendirme için sistein üçten Serine mutantı seçilir. Bu mutanttan elde edilen veriler, bu mutant için gerçekleştirilen boş çalışma ile birlikte gösterilir; ilerlemek için "Next" düğmesine tıklayın. Bir sonraki ekran, örnekli çalışmadan boş çalışmanın çıkarıldığı verileri göstermektedir.

Kinetik düğmesine tıklayarak kinetiği değerlendirmeyi seçin. Şimdi verileri bire bir etkileşim modeline uydurmayı seçin. Fit düğmesine tıkladığınızda, hesaplama yapıldıkça uyum ekranda görüntülenir.

Hazır olduğunda, kalite kontrolleri otomatik olarak uygulanır ve alt kısımda vurgulanır. Kalite kontrol maddelerini inceleyin ve ardından sensorgram verilerine bakarak sensorgramların yeterli eğriliğe sahip olduğundan emin olun. Ayrıca, toplanan veriler ile uydurulmuş model arasındaki farkları gösteren kalıntı grafiğine göz atın.

Sistematik ve rastgele olmayan sapmalara dikkat edin. Bu uyum kabul edilebilir. Şimdi rapor sekmesindeki kinetik verilere bir göz atın.

Birlenme hız sabiti, ayrışma hız sabiti ve denge ayrışma sabiti. İşlem tamamlandığında "finish"e basın ve aynı prosedürü diğer tüm mutantlar için tekrarlayın. İncelenen farklı sistatin B varyantları için CFCA analizinin temsili sonuçları burada verilmiştir.

Spesifik bağlanma konsantrasyon verileri, dakikada 10 ve 100 mikrolitre akış hızlarında elde edilen sensörgramlardan çıkarılır. İki 80 ölçümü ile belirlenen konsantrasyon, CFCA ile belirlenenle karşılaştırıldığında, çoğu durumda proteinin lösin 73 glisin varyantı için tam aktif olduğu, ancak aktif protein fraksiyonunun çok düşük olduğu açıktır. Sistatin B varyantlarının pepsine bağlanma kinetiği, tek döngülü kinetik kullanılarak belirlenir.

Sensogramlar, siyahla üst üste bindirilmiş bire bir etkileşim modeline ait kinetik verilerle birlikte, boşluk ve referans çıkarılmış verileri göstermektedir. Leucine 73 varyantı için CFCA ile ölçülen spesifik bağlanma konsantrasyonu, iki 80 ölçümü ile belirlenen toplam protein konsantrasyonunun yalnızca yaklaşık %10'udur. Kinetik parametrelerin hesaplanmasında doğru konsantrasyon kullanıldığında, Leucine 73 için asosiyasyon hızının diğer varyantlarınkine benzer olduğu açıkça görülmektedir.

Mutantların birlikleşme hızları yabani tip proteininkiyle karşılaştırılabilir olsa da, mutantların ayrışma hız sabiti yaklaşık iki kat mertebesinde daha yüksek olabilir ve buna bağlı olarak denge ayrışma sabitinde bir artış görülür. Azalan afiniteler temel olarak artan ayrışma hızlarına bağlıdır; bu durum, hem ikinci bağlanma döngüsünün hem de sistatin B'nin C terminal ucunun, kompleks oluştuktan sonra inhibitörün enzime bağlı kalmasını sağlayarak bağlanma afinitesine katkıda bulunduğunu göstermektedir. Mutantlardan birinin bağlanma aktivitesinin çok düşük olduğu ortaya çıktığı için, bu sonuca varmak adına kalibrasyonsuz konsantrasyon analizinin kullanılması gerekliydi. İş arkadaşım Pol, yapılandırılmış bir fonksiyon çalışmasında BiCore X 100'ün nasıl kullanılacağını size göstermiş oldu. Bu deneyleri gerçekleştirirken, hem konsantrasyon hem de kinetik analizlerin aynı bağlanma prosedürüne dayalı olmasına rağmen, deneysel koşulların oldukça farklı olduğunu hatırlamak önemlidir.