Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yapısal kütle spektrometrisi kullanarak büyük protein komplekslerini karakterize etmektir. Bu işlem, nano akışlı elektro sprey iyonizasyon için altın kaplama kılcal tüpler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, numune hazırlanır ve kütle spektrometresi yüksek kütle ölçümleri için kalibre edilir.

Ardından, protein komplekslerinin gaz fazında bütünlüğünü korumak amacıyla deneysel koşullar optimize edilir. Daha sonra MS ve tandem MS spektrumları elde edilir. MS spektrumları, kütle bakımından bütün kompleksle eşleşen yük durumlarını gösterirken, tandem MS deneyleri monomerlerin ve soyulmuş komplekslerin birliktelik modellerini ortaya çıkarmıştır.

Merhaba, ben Whiteman Bilim Enstitüsü'ndeki Miron Laboratuvarı'ndan Naam Kiba. Ben de Isaac Ky, ben de Michelon laboratuvarındayım. Bugün sizlere yapısal spektrometri uygulayarak büyük protein komplekslerini analiz etmenin temel prosedürünü göstermek istiyoruz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, protein komplekslerinin stok geometrisini, bileşimini ve etkileşim ağlarını tanımlamak ve karakterize etmek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Akım dışı bağlı protein komplekslerinin analizi, as emme plus veya a qua kılcal tüpleri kullanılarak hava spreyi immünizasyon tekniği ile gerçekleştirilir. Bu kılcal tüpler yaklaşık bir mikron çapında ince uçlar haline getirilebilmekte ve ardından altın gibi iletken bir malzeme ile kaplanmaktadır. Bu kılcal tüpler, burada görebileceğiniz üzere ticari olarak temin edilebilir.

Bununla birlikte, kullanımı çok daha maliyet etkindir. Hazır kullanıma uygun hale getirilmek üzere soğutulabilen ve kaplanabilen cam kılcallerin soğutma işlemi bu iğne havuzlama cihazında, kaplama işlemi ise bu kaplama cihazında gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için, iki şerit çift taraflı yapışkan pedi, aralarında iki santimetre mesafe olacak şekilde bir Petri kabının tabanına yapıştırın.

Bir cam çubuğu pedlerden birinin merkezine yerleştirin. Yapışkan ped, kılcal boruları sabit tutar ve cam çubuk, hazırlanan kılcal boruları destekleyerek uçlarının kırılmasını önler. Bir milimetre dış çap ve 0,78 milimetre iç çapta borosilikat cam kılcal borular kullanılmıştır.

Bir kılcal boruyu iğneye yerleştirin, kılcal boruyu nazikçe sabitleyin ve ısıtma filamentinin merkezinde yer alacak şekilde konumunu ayarlayın. Kılcal borular her iki uçtan sıkıca tutulana kadar kelepçeleri nazikçe sıkın. Burada gösterilen önceden tanımlanmış programı kullanarak kılcal boruyu çekin.

Ancak, çekici programlama sürecinin deneme yanılma yoluyla ilerlediğini unutmayın. Kabul edilebilir bir uç şekli elde edilene kadar, çekilen her kılcal boru iki adet nihai şekilli kılcal boru oluşturur. Çekilen kılcal boruları cihazdan çıkarın ve uçları kontrol edin; deforme olmuş veya kırılmış olanları atın.

Kılcal tüpleri Petri kabına yerleştirmek için küt uçlu konumlandırma cımbızlarını kullanın. Kılcal tüplerin tabanı yapışkan pede tutturulmalı ve üst kısmı uçları yukarı bakacak şekilde cam çubuğa yaslanmalıdır. Petri kap dolana kadar kılcal tüpleri çekmeye devam edin.

10 santimetre çapındaki bir kaba yaklaşık 80 kapiler sığar. Ardından, kapilerleri altınla kaplayın. Plakayı altın spütter kaplama cihazına yerleştirin.

Gaz beslemesinin üretici talimatlarına göre seçildiğinden emin olun ve önceden tanımlanmış bir kaplama döngüsünü etkinleştirin. Kapillerler eşit şekilde altın rengi alana kadar kaplama işlemi üç ila altı kez tekrarlanır. Kapillerler hazır olduğunda, kütle spektrometresini kalibre etme işlemine geçin.

MultiPro kompleksleri üzerinde yürütülen deneylerin çoğu, yüksek kütleler için modifiye edilmiş Waters giriş sistemine sahip, şu anki gibi bir Elektrospray quadruple time of flight kütle spektrometresi ile gerçekleştirilir. Protein örneğini yüklemeden önce, kütle spektrometresini sezyum iyodür kullanarak kalibre edin.

Öncelikle, saflaştırılmış su içerisinde 100 mg/mL konsantrasyonunda bir sezyum çözeltisi hazırlayın; sezyum, yüksek kütle kalibrasyonu için kullanılır. Tek yüklü tuz kümeleri, 393 m/z'den 10.000'in çok üzerine kadar uzanan geniş bir kütle aralığına yayılır. Küt uçlu cımbızlar kullanarak Petri kabından kaplamalı bir kapiler alın ve kapilere iki µL sezyum çözeltisi yükleyin.

Einor jel yüklü bir uç kullanın. Çözeltiyi, manuel olarak veya bir santrifüj adaptörü kullanarak kılcal borunun ucuna doğru kaydırın. Kılcal boruyu kılcal boru tutucusuna yerleştirin ve ucun tutucunun kenarından yaklaşık 10 milimetre uzakta olacak şekilde ayarlayın.

Kılcal boruyu bir optik mikroskop altına yerleştirin ve ucunu düzeltmek için ince uçlu AA tipi cımbızlar kullanın. Kılcal boru içerisinde akışı engelleyebilecek hava kabarcıkları olmadığının ve borunun tıkalı olmadığının doğrulanması önemlidir. Ayrıca, altın kaplamanın kılcal borudan soyulmadığından emin olun.

Eğer öyleyse, kapilerle değiştirin veya uç kısmını kırparak kaplanmamış bölümü uzaklaştırın. Ardından, kapiler tutucuyu nano akışlı ESI arayüzüne bağlayın. Kapilerle zarar vermemek için XY, Z tablasını geriye doğru döndürün ve tablayı etkinleştirilmiş konumuna itin.

Kılcal tüp, kon orifice'inden 1 ila 10 mm mesafeye yerleştirilmelidir. Sprey başlayana kadar kılcal voltaj ve düşük nano akış basıncı uygulayın. Ardından, nano akış basıncını minimum değere düşürmeye çalışın.

XYZ tablasının konumu, kapiler voltajı, nano akış basıncı ve desolvasyon gaz akışı ayarlanarak sinyal yoğunluğunu optimize edin. Geniş bir kütle aralığındaki sezon pik serilerini saptamak için hızlandırıcı voltajlar optimize edilmelidir. Burada kullanılan parametreler; kapiler için 1.3 ile 1.7 kilovolt, örnek konisi için 80 ile 150 volt ve nazik desolvasyon koşulları gerektiren yüksek kütleli iyonların iletimini optimize etmek için ekstraksiyon konisi için bir ile üç volttur.

Kaynak ile analizör arasındaki ilk vakum aşamasında arka basınç beş ila altı milibara yükseltilir. Arka basıncı yükseltmek için, sinyal yoğunluğu üzerindeki etkisini izlerken izolasyon valfini kısmen kapatarak kaynak vakum hattının scroll pompaya olan iletkenliğini dikkatlice azaltın. Kütle spektrometrelerinin kurulumu tamamlandığında, 1000 ile 15.000 arasındaki bir ana yük oranı aralığında saniyede bir tarama olacak şekilde yaklaşık 30 tarama toplayın; veri toplama işleminden sonra uçuş süresini uygun kalibrasyon tablosunu kullanarak kalibre edin.

Kalibrasyon tamamlandığına göre, protein örneği yüklenebilir. Örnek, kütle spektrometresi kalibre edilmeden önce hazırlanır; düşük mikromolar konsantrasyonlar gereklidir. Gerekirse, santrifüj ultrafiltrasyon cihazlarını kullanarak örneği konsantre edin.

Kullanımdan önce protein kompleksinin cihaz membranına absorbe olmadığını doğrulayın. Sadece hacim ve UV absorbansı kontrol edilerek uçucu çözeltiler NESI için kullanılabilir, bu durum genellikle tampon değişimini gerekli kılar. Tuzların, tampon moleküllerinin veya diğer uçucu olmayan tüm addüktlerin kalıntılarını gidermek için bir mikro santrifüj jel filtrasyon kolonu kullanılabilir.

Bunun yerine, örneği süspansiyon haline getirin. Sulu bir amonyum asetat çözeltisi kullanın. Bu kritik adım, spektrumların kalitesini belirler.

Maksimum değişim sağlanana kadar, cihaz başına 1,3 faktöründen daha az olacak şekilde minimum seyreltme ile tampon değişimi işlemini üç kez tekrarlayın. Hem konsantrasyon hem de tampon değişimi gerekiyorsa, bunlar bu bölümün başında gösterildiği gibi santrifüj ultrafiltrasyonu kullanılarak birlikte yapılabilir. Ardından, numuneyi sezyum iyodür kalibrasyonunda gösterildiği gibi yükleyin ve püskürtmeyi başlatın.

Sinyal tespit edilene kadar spreyin ilk optimizasyonunu yaparak başlayın. M'nin kompleksin kütlesi olduğu, ortalama yük durumu için gösterilen denklemi kullanın. Bununla birlikte, Dalton cinsinden yük durumlarının kesin konumu proteine bağlıdır.

Kompleks ayrışmasını önlemek için demir kaynağını ısıtmayın. Isıtıcıyı kapatın veya sıcaklığı 40 °C'nin altında tutun. Kılcal boru konumunu, örnek konisi ve ekstraktör voltajlarını değiştirin.

Demir iletimini maksimize etmek için olası bir başlangıç noktası, kon voltajı 100 volt ekstraktör konu, bir volt ve kapiler voltajı 1,5 kilovolt şeklindedir. Spektumlardaki meydana gelen değişikliği kontrol edin. Desolvasyonu iyileştirmek ve kalıntı su ile tampon bileşenlerini uzaklaştırmak için bu parametreleri nano akış basıncı ile kombinasyon halinde optimize edin.

Çarpışma hücresindeki gaz basıncında bias voltajını artırın. Tipik bias voltajları, dakikada 1 ila 10 mililitre tuzak gaz akışı ile 10 ila 100 volt aralığındadır. Kompleksin birleşmesini önlemek için bu işlemi dikkatli bir şekilde gerçekleştirin, tuzak ve transfer çarpışma enerjilerini ayarlayın.

Yüksek kütleli iyonların iletimi için genellikle 10 ile 30 volt arasındaki daha yüksek voltajlar gereklidir. Bu noktada, burada gösterildiği gibi kompleksin çarpışma kaynaklı disosiyasyonundan kaçınmak önemlidir. Kararlı bir sinyale ulaşıldıktan sonra, stabil spreyi korurken nano akış basıncının ve kapiler voltajın minimum değerlere düşürülmesi önerilir.

Birkaç tarama topladıktan sonra, tandem kütle spektrometrisi ile kompleksin bileşenlerini tanımlama işlemine geçin. Protein kompleksi için optimum ve stabil bir sinyal elde edildiğinde, bir öncül iyon seçin ve izolasyon genişliğindeki kütle merkezini ayarlayın. Genel olarak, 12'lik düşük kütle çözünürlüğü ve 13 ile 15 arasındaki yüksek kütle çözünürlüğü için; yüksek kütleli düşük yüklü parçalanma ürünlerini tespit etmek amacıyla geniş bir kütle aralığı kullanın ve ardından ms gerçekleştirmek için bu aralığı istenen değerlere düşürün.

MS, öncül demiri ayrıştırır. Çarpışma enerjisini (kısaltması CE) ve çarpışma hücresindeki basıncı artırarak, ya tuzak ya da transfer CE'sini kademeli olarak 10 ila 20 voltluk adımlarla artırın ve çarpışma gazı basıncını dakikada sıfır ila beş mililitreye yükseltin. Optimal aktivasyon koşullarına ulaşılana kadar spektrumlardaki değişimleri izleyin. Yüksek aktivasyon enerjisi, sağlam kompleksten bir veya daha fazla alt birimin ayrışmasını tetikleyebilir ve farklı alt birimlerin etkileşim afinitelerini netleştirebilir.

ms MS analizi için birden fazla yük seçin. Üst üste binen bileşenlerin olduğu durumlarda, bir dizi tandem MS spektrumunun elde edilmesi, farklı popülasyonların yük serilerinin çözümlenmesine yardımcı olur. Ayrıca, daha yüksek yük durumları, düşük yük durumlarına kıyasla daha kolay ayrışır; MS ve ms spektrumlarını üst üste getirin.

Seçilen öncül iyonun izolasyonunu doğrulamak için MS spektrumları. MS ve ms/MS ile bütün kompleksin karakterizasyonuna ek olarak, ms/MS hafif denatüre edici koşullar altında çözeltide daha küçük alt kompleksler oluşturur ve bunları da karakterize eder.

Alt komplekslerin MS ve ms MS analizleri, kompleksin alt birim mimarisini tanımlamanın temelini oluşturur; alt birimler arası etkileşimlerin kısmi olarak bozulması için, konsantrasyon %50'ye ulaşana kadar kademeli olarak organik çözücüler ekleyin veya çözeltinin pH'ını amonyak veya formik asit ekleyerek %4 konsantrasyona kadar değiştirin. Son olarak, kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin kütlelerini belirlemek için, denatüre edici koşullar altında spektrum elde etmek önemlidir. Bu işlem, %1 formik asit içeren %25 ila %75 su-asetonitril oranlı bir elüsyon çözücüsü ile zip tip C4 kullanılarak gerçekleştirilebilir; toplanan tüm veriler, ekteki yazılı protokolde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde işlenir ve sonuçlar analiz edilir. Protein kompleks örneği yüklenmeden önce, kütle spektrometreleri sezyum iyodür kullanılarak kalibre edilir.

Kırmızıyla işaretlenmiş eşit aralıklı pik serisi, 393'ten 10.000'in çok üzerine kadar geniş bir ana yük oranı aralığına yayılmaktadır. Bunlar, genel kompozisyonu sezyum artı kompleksi olan tek yüklü tuz kümelerine atanmıştır. Siyahla işaretlenmiş ana pikler arasındaki ek sinyaller, sezyum iki artı kompleksi ve sezyum üç artı kompleksi serisinin çift ve üç yüklü türlerinden kaynaklanmaktadır.

Yüksek kütleli kümelerin saptanabilmesi için başlangıç vakum aşamasındaki basıncın artırılması gereklidir. Basıncın yüksek kütleli pikler üzerindeki etkisi, burada 1,2 ve 5,3 millibar'lık basınç geri okumalarıyla gösterilmiştir. Daha yüksek basınç için elde edilen kütle spektrumu burada genişletilmiş olarak sunulmuştur.

Burada, 3000 ile 5.000 kütle-yük oranı arasında bir yük durumu dağılımı veren bir lektin varyant kompleksinin kütle spektrometrisi örneği görülmektedir. Ancak, iyonların yeterince giderilmemesi nedeniyle pikler geniştir. Hızlandırma koşullarında artış sağlayan biyas voltajının dört volttan 15 volta çıkarılması, kalıntı su ve tampon bileşenlerinin uzaklaştırılmasını sağlayarak yüksek çözünürlüklü bir spektrum üretir; ölçülen kütle pentamerik bir komplekse karşılık gelmektedir.

Ardından, tandem MS analizi için +15 yük durumu seçildi. Çarpışma enerjisindeki artış, 1,664 kütle/yük oranı merkezli yüksek yüklü bir monomerin ve 5,000 ile 8,000 kütle/yük oranı aralığında soyulmuş bir tetramerik kompleksin salınmasına neden olur. Lektin varyant kompleksi, kompleks birlikteliğine yol açan denatüre edici koşullar altında da incelendi.

Bu sayede, kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin kesin kütlesi belirlenebilir. Size yüksek kütleli iyonların MS ve tandem MS spektrumlarının nasıl elde edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, numunenin uygun şekilde hazırlanması ve yalnızca kütle spektrometrisi ile uyumlu volatilite tamponlarının kullanılması önemlidir.

İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.