Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, kültürde manipüle edilmiş OO bölgelerinden türetilen gelişmekte olan embriyolar elde etmektir. Bu işlem, öncelikle bir dişiden donör oo bölgelerinin izole edilmesi ve bunların kültürde istenilen şekilde manipüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bu sitlerin progesteron kullanılarak olgunlaşmaya teşvik edilmesi ve yumurta döşemeyi uyarmak için potansiyel konakçılar olan dişilerin gonadotropin ile enjekte edilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, donör sitlerin vital boyalarla boyanması ve konakçı olarak görev yapacak bir dişinin hazırlanmasıdır. Prosedürün son adımı, donör sitlerin cerrahi olarak konakçının vücut boşluğuna aktarılması ve birkaç saat sonra aktarılan yumurtaların geri kazanılıp dölletilmesidir. Sonuçta, deneysel olarak manipüle edilen donörden elde edilen normal şekilde bölünen embriyolar oluşur.

Sitositler, tıpkı normal embriyolar gibi elde edilebilir ve analiz edilebilir. Merhaba, ben Iowa Üniversitesi'nden Doug Houston. Bugün, konak transfer prosedürünün nasıl gerçekleştirileceğini göstermek için Cold Spring Harbor Xap kursundayız.

Laboratuvarımızda, maternal gen ürünlerinin rollerini incelemek ve erken zap gelişimindeki rollerini belirlemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Cerrahi işleme başlamadan önce, cerrahi alanın dezenfekte edildiğinden, taze ortamların ve steril aletlerin hazır olduğundan emin olun.

Sütür iğnesini iğne tutucu ile istenen yönde kavrayın. Anestezi uygulanmış dişi bir kurbağayı, sırt üstü gelecek şekilde nemli bir cerrahi mendilin üzerine yerleştirin. Küçük iris makasları kullanarak, karnın alt kısmında, orta hattın yan tarafındaki deride bir santimetrelik bir insizyon yapın.

Karın kasını kesmeyin. Kas tabakasını ve etraftaki beyaz renkli fasyayı kaldırmak için pens kullanın. Kas boyunca düz ve tek bir hızlı kesi yapmak için iris makası kullanın.

İnsizyonu, yumurtalığı açığa çıkaracak şekilde bir santimetreye kadar genişletin. Yumurtalığı kavramak ve bir lobu dışarı çekmek için pens kullanın. Lobu, gövde duvarı seviyesinden kesip almak için makas kullanın.

Dokuyu, oosit kültür ortamı veya OCM içeren 90 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve yumurtalık kalitesini hemen bir diseksiyon mikroskobu altında değerlendirin. Birkaç oosit pens ile ayrılabilir. Oositler sert, tek tip boyut ve renkteyse, kurbağadan istenilen miktarda yumurtalık dokusunu çıkarın ve OCM içeren 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Kesi yerini kapatın. İğneyi, hem kas hem de fasyadan geçtiğinden emin olarak, kesinin birkaç milimetre lateralinden yerleştirin. Sütürün kuyruk kısmını tamamen çekmemeye dikkat ederek, iğneyi yönlendirmek için forseps kullanın.

Yarayı, basit ayrı dikiş paterni ve cerrahi kare düğümlerle kapatın. Teknik, beraberindeki metinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Dikiş işlemini cilt tabakasıyla tekrarlayın.

Dişiyi deiyonize su ile durulayın ve serin suyla dolu bir iyileşme kovasına yerleştirin. Cerrahi işlem biter bitmez, yumurtalığı alt bölümlere ayırmak için makas kullanın. Münferit lobları açın, düzleştirin ve iki santimetrekarelik parçalar halinde kesin.

Temiz besiyeri ile durulayın ve pens kullanın. Bireysel sitleri izole etmek için beş ila altı parçayı, OCM içeren taze bir 90 mm'lik kaba aktarın. Parçalardan birini küçük bir besiyeri kabına aktararak başlayın ve bir diseksiyon mikroskobuna getirin.

Üç ila 500 oositi manuel olarak ayırmak için saatçi pensi kullanın. İkinci bir pens çiftiyle, stok yakınındaki tam gelişmiş altıncı evre oositini çevreleyen bağ doku tabakasını tutun. İlk pens çiftiyle oosite bitişik olan yumurtalığı kavrayın.

Folikül tabakasını yırtmak için oositin üzerinden hafifçe çekin. Siti dokudan dikkatlice ayırın. Folikülleri uzaklaştırılmış sitlerde görünür kan damarları yoktur ve bunlar, folikülleri sağlam olan sitlerden daha gevşektir.

100 ila 150 oosit grubunu, sekiz mililitre OCM içeren 60 milimetrelik kültür kaplarına aktarmak için pamukla tıkanmış, uçları ateşle cilalanmış bir pipet kullanın. Oositleri kapları içerisinde 18 °C'de saklayın. Oositler artık istenilen sayıda protokol uyarınca antisense oligonükleotidler veya mRNA'lar ile mikroenjekte edilebilir ve ardından 18 °C'lik bir inkübatörde OCM içerisinde kültüre edilebilir.

Transfer için oositleri, izolasyondan sonraki 96 saat içinde, transferin gerçekleştirileceği günden önceki akşam kullanın. Gerekli oositleri olgunlaştırmak için, oositleri içeren ortama, son konsantrasyon iki mikromolar olacak şekilde 16 mikrolitre bir milimolar progesteron ekleyerek inkübe edin. Aynı akşam 18 derece Celsius'ta 10 ila 12 saat boyunca inkübe edin ve yumurtlamayı başlatmak için üç ila beş dişiye kurbağa başına 1000 ünite insan koriyonik gonadotropini enjekte edin.

Transfer gününün sabahında dişileri oda sıcaklığında veya 18 °C'de gece boyunca bekletin. Kültürlenen sitlerin olgunlaştığından emin olmak için diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Vital boyaları ekleyin ve 10.000 G'den daha yüksek bir hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Kalıntılardan kaynaklanan arka planı azaltmak için, her bir oosit deneysel grubuna 80 µL uygun canlılık boyası ekleyin. Bir sallayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Boyanan yumurtaları 90 mm'lik taze o cm içeren bir kaba aktarın ve yıkamak için kısa süre boyunca dairesel hareketlerle karıştırın.

Sitositlerin aktarımı için kullanılacak bir pipet hazırlayın. Konik kısmın yaklaşık iki santimetre altına bir elmas kalemle çizik atın ve temiz bir şekilde kırın. Bu işlem, bir oositin sığabileceği büyüklükte, 1,5 milimetre açıklığa sahip bir pipet oluşturmalıdır.

Ucu kapatmadan, kenarlar pürüzsüz hale gelene kadar uç kısmını cilalayın. Oosit transplantasyonu. Cerrahi işlem mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Anestezi uygulanmış, kaliteli yumurta veren bir dişiye daha önce yapıldığı gibi bir insizyon yapın. Bu insizyon, transfer borusunun sığabileceği minimum uzunlukta olmalıdır. Bir santimetreden daha az bir derinlikte pipetleme yapın.

Deneysel oositlerin bulunduğu kabı, oositleri kabın merkezinde toplamak için hafifçe çalkalayın. Hazırlanan pastür pipetiyle mümkün olduğunca çok oositi çekin. Kurbağaya aktarılan sıvı miktarını minimize etmek için oositlerin pipetin ucuna çökmesini bekleyin.

Kas ve fasyanın bir flebini kavramak ve kaldırmak için pens kullanın. Pipetin ucunu insizyona yerleştirin ve oositlerin vücut boşluğuna yavaşça süzülmesini sağlayın. Tüm oositler aktarılana kadar işlemi tekrarlayın.

Oositlerin insizyondan dışarı taşmasını önlemek için kas tabakasını serbest bırakmayın. İnsizyonun her iki yanını tutmak ve oositlerin vücut boşluğuna yerleşmesini sağlamak için pens kullanın. İlk düğüm atılana kadar yukarı doğru gerginliği korumaya dikkat ederek, kas ve fasya tabakasını daha önce yapıldığı gibi dikmeye başlayın.

Cildi dikin. Kurbağayı deiyonize su ile durulayın ve daha önce olduğu gibi iyileşmesine izin verin. Kurbağa, ameliyattan iki ila üç saat sonra normal şekilde yumurtlamaya başlamalıdır.

Dişi yumurtlamayı bırakana kadar her yarım saatte bir normal sıkma yöntemiyle yumurtaları toplayıp bir toplama kabına alın. Toplanan yumurtalara, 1X XMMR içinde taze toplanmış sperm süspansiyonundan 4 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin. Yumurtaları oda sıcaklığındaki sıvı ile bolca yıkayıp durulayın.

Aktivasyon ve parçalanmanın gerçekleşmesi için XMMR oda sıcaklığında inkübe edilir. Jöle tabakasını kaldırmak için herhangi bir aşamada sistein kullanılabilir. Aktarılan embriyolar daha sonra renklerine göre ayrı kaplara ayrılabilir ve normal embriyolar gibi kültüre edilebilir.

Genellikle, aktarılan yumurtaların üçte ikisinden fazlası döllenmeden sonraki dakikalar içinde aktive olur ve animal kutupta güçlü kortikal kontraksiyon sergiler. Çoğu deneyde, aktarılan yumurtaların yarısından fazlası normal ilk bölünme sürecini gerçekleştirir. Bazı durumlarda bölünme, elimizdeki konakçı yumurtalara kıyasla yaklaşık 20 dakika gecikebilir.

Transfer edilen embriyoların %30 ila %60'ı normal şekilde gastrülasyona girecek ve nöral aşamanın ötesinde hayatta kalacaktır. Transfer edilen embriyolar, gelişimin birçok günü boyunca canlı boya renklerini koruyacaktır. Enjekte edilmemiş kontrol oositlerden elde edilen embriyolar, beklendiği gibi normal görünecektir.

Buna karşılık, örneğin beta katenin ve antisense oligoları enjekte edilmiş oositlerden elde edilen embriyolar, merkezileşmiş bir görünüme sahip olacaktır. Kültürde manipüle edilmiş oositlerden nasıl embriyo elde edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, sağlıklı ve tam gelişmiş donör oositlerle başlamak ve yüksek kaliteli yumurtalara sahip konak dişiler kullanmak önemlidir. Ayrıca, yöntemin başarısı oositlerin izole edilme ve cerrahi işlemlerin gerçekleştirilme hızıyla ilişkili olma eğilimindedir. Bu nedenle, tutarlı sonuçlar elde etmeden önce belirli bir pratik yapmak gerekebilir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.