Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis
23 Mayıs 2010
Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.
Bu prosedürün genel amacı, embriyonik epitel hücre morfolojisini analiz etmek için canlı görüntüleme ve basit nicelik belirleme yöntemlerini göstermektir. Bu, öncelikle tüm araç ve gereçlerin hazır hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kurbağa embriyolarından X explanların çıkarılması ve uzun süreli kültür için kameralarda muhafaza edilmesidir.
Prosedürün üçüncü adımı, epitel hücrelerin gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntülerinin toplanmasıdır. Prosedürün son adımı, Image J kullanarak epitel hücrelerin morfolojik detaylarının nicelleştirilmesidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi aracılığıyla izlenen hücre alanlarını ve membran yoğunluklarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'ndeki Davidson Laboratuvarı'ndan Sagar Joshi.
Bugün sizlere, Xenos lavia embriyonik epitel hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi ve kantitatif analizi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, gerçek zamanlı hücrele iskelet değişikliklerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.
Hayvan şapkalarını kültüre etmek için odacıkları hazırlamak amacıyla, özel bir akrilik odacığı veya küçük bir naylon pulu 45 by 50 milimetre boyutundaki büyük bir lamel camına silikon gres kullanarak sabitleyin. Odacığa, üçte bir XMBS içinde %1 BSA içeren bir mililitre ekleyin. Küçük lamel camı parçalarını aynı solüsyonla kaplayın ve oda sıcaklığında iki ila dört saat veya dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.
X explanın cama yapışmasını azaltmak için, chamber'ı DFA besiyerisi ile durulayın ve doldurun; The xs'leri aktarmadan hemen önce, cover slip fragmanlarını aynı şekilde durulayın. Ardından, bunları bir third XMBS içinde, istenen aşamaya kadar istenen MR NA ile bir ila dört hücre aşamasında mikroenjeksiyonu yapılmış DFA kültür embriyolarının bulunduğu bir kaba daldırın. Embriyoları, bir diseksiyon stereo mikroskobu altında DFA içeren bir kaba aktarmak için eğimli ağızlı bir transfer pipeti kullanın.
Embriyolardan bir hayvan CapEx implantı çıkarmak için pens kullanın. Bir embriyoyu sabit konumda tutmak için saç döngüsü kullanın. Hayvan kutbunda küçük bir insizyon yapmak için saç bıçağı kullanın.
İnsizyonu genişletmek ve kep ektoiderminini çıkarmak için tekrarlayan yumuşak flick kesimleri yapın. Üç veya dört eksplanı aynı yöntemle kesin. Ardından, onları hazırlanmış kültür odasına taşımak için bir transfer pipeti kullanın.
Epitelyumun odağına bakacak şekilde her bir X explanı saç döngüsü kullanarak yerleştirin. Pens yardımıyla, bir lam yerleştirme camı parçasını merkezinden tutun.
Uçlarını silikon gresine batırın. Her bir X explan üzerine bir fragman yerleştirin. Her bir fragmanı küçük silikon gresi noktalarıyla hafifçe sabitleyin.
X açıklığını aşırı kuvvetle tamamen kırmamaya dikkat ederek, hazneyi DFA ile doldurun ve haznenin üst kenarlarını silikon gres ile kaplayın. Ardından, üst kısmı 24 x 40 milimetre boyutunda bir lam ile kapatın.
Hava kabarcıklarını azaltmak için oda içerisindeki DFA seviyesini ayarlayın ve taşan kısımları peçete ile kurulayın. X bitkileri artık sızdırmaz oda içerisinde oda sıcaklığında bir gün boyunca uzun süreli olarak kültüre edilebilir; bir konfokal mikroskobun 20x objektifini konumlandırın. X açıklığı içeren odayı mikroskop tablasına yerleştirin ve parlak alan altında sabit tutmak için odanın üzerine küçük denge ağırlıkları koyun.
Odaklamayı ayarlayın ve yüzeysel hücrelerin apikal uçlarını görüntülemek için kaba pozisyonlama kullanın. Floresan moda ve daha yüksek büyütmeli bir objektife geçin. Açılmış epitelyumun tekil görüntülerini veya zaman ayarlı videolarını toplamak için, mümkün olan en iyi görüntüyü elde edecek şekilde görüntüleme ayarlarını optimize edin.
Ayarlama ve görüntüleme ipuçları için bu protokolün yazılı bölümüne bakınız. Lazer gücünü mümkün olduğunca düşük tutun. x explan epitelyumunun görüntülerini veya zaman atlamalı videolarını kaydedin.
Veri toplama konusundaki öneriler için protokolün yazılı kısmına bakınız. Konfokal görüntü dosyaları çeşitli yöntemlerle veri madenciliği için kullanılabilir. Burada, bio formats eklentisi ile Image J analiz yazılımı kullanılarak veri dosyalarının nasıl analiz edileceğine dair iki örnek yer almaktadır.
Bir epitel hücrenin hücre alanını ölçmek için, analiz (analyze) menüsünü açın ve ölçümleri ayarla (set measurements) seçeneğine tıklayın. Araç çubuğundan seçim aracını (selection tool) seçin ve hücrenin etrafını çizin; analiz menüsünden araçlar (tools) ve ardından ROI yöneticisi (ROI manager) seçeneğini belirleyin. İlgi alanları yöneticisini (regions of interest manager) açmak için control t tuşlarına basın.
Taslağı ROI yöneticisine eklemek için, görüntüden istenilen sayıda taslak seçip ekleyin. Ardından, ROI setini ROI yöneticisine kaydetmek için kaydet düğmesine tıklayın. Ölç düğmesine tıklayın.
Sonuçlar penceresi artık her bir ROI'nin ölçülen alanlarını gösterecektir. Bir hücre zarının yoğunluğunu ölçmek için ImageJ araç çubuğundan düz çizgi aracını seçin. Zar boyunca dik bir çizgi çizin.
Önceki örnekte olduğu gibi CTRL T tuşlarına basın. Seçimi ROI yöneticisine eklemek için analyze menüsünü açın ve hat boyunca bağıl yoğunlukların grafiğini oluşturmak için plot profile seçeneğine tıklayın. Grafiği bir görüntü olarak kaydetmek için, açılan yeni grafik penceresindeki save düğmesine tıklayın.
Liste menüsünden dosyaya gelin ve ardından farklı kaydet seçeneğini kullanın. Size az önce, çıkarılmış hayvan CapEx explanlarından embriyonik epitel hücrelerinin nasıl canlı görüntüleme ile izleneceğini ve nasıl nicelendirileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, DFA'ya antibiyotik ve antibiyotik eklemeyi hatırlamak önemlidir. Bakteriyel ve fungal büyümeyi önlemek için, explanları lamellerin altında bastırırken ekstra dikkatli olun; çünkü gerekenden fazla basınç uygulamak explanı ezebilir.
Maksimum kalitede görüntü verileri elde etmek için konfokal mikroskobun optimal ayarlara sahip olduğundan emin olmak da önemlidir. İşte tüm detaylar bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Xenopus'ta embriyonik epitel hücre morfolojisini incelemek için kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini göstermektedir. Kurbağa dokularının izole edilmesine ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücrelerinin görselleştirilmesine yönelik yöntemleri vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Xenopus embriyonik epitelleri, hücre davranışlarını incelemek için bir model teşkil eder.
- Canlı hücre görüntüleme, geleneksel histolojiyi tamamlar.
- Epitel morfogenezini anlamak, gelişimsel çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Konfokal mikroskopi, hücresel dinamiklerin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Epitel hücreler için canlı görüntüleme tekniklerini göstermek.
- Epitel hücrelerin morfolojik detaylarını nicelleştirmek.
- Kurbağa dokularının izole edilmesi ve kültüre edilmesi için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için araç ve gereçlerin hazırlanması.
- Kültür için kurbağa embriyolarından doku eksizyonu yapılması.
- Epitel hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin toplanması.
- Image J yazılımı kullanılarak hücre morfolojisinin nicelleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Canlı epitel hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edildi.
- Kantitatif analiz, takip edilen hücre alanlarını ve membran yoğunluklarını ortaya çıkardı.
- Canlı görüntüleme, morfogenez sırasında hücre davranışına dair bilgiler sağladı.
- Yöntemler, kurbağa dokularının uzun süreli kültürü için doğrulandı.
Sonuçlar
- Canlı hücre konfokal mikroskobu, epitel hücrelerin incelenmesinde etkilidir.
- Bu yöntemler, çeşitli gelişimsel biyoloji çalışmalarına uygulanabilir.
- Sonuçlar, epitel morfogenezinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik
Xenopus laevis embriyonik epitel hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi ve kantitatif analizi, erken keşif ve hedef doğrulaması ile ilgili morfogenetik süreçlerin sorgulanması için dinamik bir platform sağlar. Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi, hücresel morfolojinin ve protein lokalizasyonunun gerçek zamanlı ölçümüne olanak tanıyarak gelişimsel biyoloji modellerindeki öngörücü güveni destekler. Bu iş akışı, preklinik araştırmalarda mekanistik risk azaltma ve portföy önceliklendirmesi için epitel sistemlerinin translasyonel değerini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hücre iskeleti değişikliklerinin ve hücre şekli dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak doğrudan gözlemlenmesini sağlar.
- Epitel morfolojenezinde yer alan moleküler hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Hücre alanı ve membran yoğunluğu değişikliklerini nicelleştirerek mekanistik risk azaltmaya olanak tanır.
- Gelişimsel yolakların hipotez odaklı sorgulanması için bir platform sunar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt aşamadaki kantitatif görüntüleme iş akışları için valide edilmiş canlı hücre sistemleri hazırlar.
- Tekrar üretilebilir Image J analizleri kullanarak morfolojik parametrelerin ölçümünü standartlaştırır.
- Epitelyal hücre davranışını etkileyen bileşiklerin yüksek içerikli taramasını sağlar.
- Karşılaştırmalı çalışmalar için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Dinamik epitelyal süreçleri yakalayarak hastalıkla ilgili modellerle uyum sağlar.
- Kantitatif çıktılar aracılığıyla keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Öngörücü ve gerçek zamanlı hücresel okumalar sunarak biyolojik riski azaltır.
- Protein lokalizasyonunun canlı görüntülemesi yoluyla biyobelirteç tanımlamasını destekler.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, sağlam veri üretimi için canlı hücre görüntülemeden yararlanarak, erken hipotez testlerinden preklinik model doğrulamasuna kadar uzanan keşif sürecine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Gerçek zamanlı morfolojik analiz yoluyla hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını sağlar.
- Tarama: Deney geliştirme ve bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için hücre alanı ve membran yoğunluğunun hassas ölçümlerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili sistem modellemesini destekleyerek keşif ve preklinik araştırmalar arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli epitel çalışmalar için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Epitel biyolojisinde öngörü güvenilirliğini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Canlı hücre görüntüleme iş akışlarında standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği teşvik eder.
- Stratejik Değer: Sağlam nicel veriler sağlayarak devam/durum kararlarına yol gösterir ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Keşif aşamasındaki varlıkların riskten arındırılmış önceliklendirmesini ve ilerlemesini destekler.
Uygulama Hususları
- Konfokal mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Özel görüntüleme cihazlarına ve analiz yazılımlarına (örneğin, Image J) erişim gerektirir.
- Görüntüleme ve ölçüm protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı model sistemler veya doku türleri için adaptasyon gerektirebilir.
- Veri kalitesini sağlamak için optimal kültür koşullarına ve dikkatli numune işlemeye bağımlıdır.
