Deneysel metastaz Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kuyruk ven enjeksiyonları yoluyla insan kanser hücrelerinin metastatik yeteneklerini test etmektir. Hücreler, immün yetersiz farelere enjekte edilmek üzere hazırlanır. Ardından hücreler, bir ila iki ay sonra akciğer metastazları oluşturacak olan immün yetersiz farelere enjekte edilir.

Fareler diseke edilir, akciğer metastazları sayılır ve kültüre edilir. Bu tip bir analizden elde edilen sonuçlar, belirli bir kanser hücresi tipinin metastaz derecesini gösterir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Biyomedikal Genetik Bölümü'ndeki Dr. LE Laboratuvarı'ndan Sonali Mohanty.

Bugün size deneysel metastaz analizi gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Kanser metastazını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Yaklaşık %70 yoğunluğa ulaşmış hücrelerle başlayın; plakadaki medyumu aspire edin ve bir kez 1X PBS ile nazikçe yıkayın. Ardından, iki mililitre %0,05 Trypsin ekleyin. Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için plağı nazikçe sallayın.

Hücrelerin ayrılmasını mikroskop altında gözlemleyin. Tripsin aktivitesini durdurmak için FBS içeren yeterli miktarda besiyeri ekleyin. Ardından 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Konsantrasyon belirlendikten sonra, hücre peletini bozmadan yaklaşık 200 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini dikkatlice uzaklaştırın ve nihai konsantrasyon yaklaşık 5 × 10⁶ hücre/mL olacak şekilde uygun hacimde Hank's dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ekleyerek yeniden süspande edin.

Ardından, Falcon'ın 70 mikrometrelik hücre süzgecinden süzün. Büyük hücre agregalarını dışlamak için, pipet ucunu beş mililitrelik bir kültür tüpünün üzerine yerleştirilmiş olan filtrenin doğrudan üzerine koyun. Süspansiyonu hızlıca filtreden geçirerek tüpün içine boşaltın.

Canlılığı belirlemek için hücreleri tripan mavisi kullanarak tekrar sayın. Enjeksiyondan önce canlılık %90'ın üzerinde olmalıdır. Ardından, mililitre başına 2,5 × 10⁶ hücre olacak şekilde nihai konsantrasyona seyreltin.

Buz üzerinde tutun. İmmünodeficient bir farenin kuyruğunu nazikçe yakalayın ve sırtı yarığa gelecek, kuyruğu arkadaki küçük açıklıktan dışarı çıkacak şekilde fare sabitleyicinin içine çekin. Halkayı yarıık boyunca yavaşça içeriye doğru kaydırın.

Halka farenin ağzını kavradığında, onu yerine sabitleyin. Fare serbestçe hareket edememeli, ancak solunum hızı normal olmalıdır. Ana kuyruk venlerini bulun.

Bir fare kuyruğunda dört ana kan damarı bulunur. Arterler kuyruğun dorsal ve ventral taraflarında yer alırken, venler lateral taraflarda bulunur.

Hazırlanan hücrelerden en az 200 microliters miktarında bir mililitrelik şırıngaya çekin. 30 gauge yarım iğne takın ve hava kabarcıklarını dışarı itin. Şırıngadaki nihai hacim 200 microliters olmalıdır.

Kuyruğun distal ucuna enjeksiyon yapmak için hazırlık yapın. Böylece, ilk deneme başarısız olursa, ikinci bir deneme için kuyruğun daha proksimal bir bölgesi kullanılabilir. Enjeksiyon bölgesini %70 ethanol ile sildikten sonra, kuyruğu düz bir şekilde çekin.

Ucu başparmağınızla tutun ve enjeksiyon noktasını işaret parmağınızla destekleyin. İğneyi vena içine yerleştirin ve hücreleri enjekte edin. Enjeksiyon sırasında iğnenin ve şırınganın vena ile paralel olduğundan emin olun.

Aksi takdirde, iğne damar duvarını deler ve hücreler komşu kuyruk dokularına enjekte edilir. İşlem başarıyla tamamlandıysa iğneyi geri çekin. Enjeksiyon bölgesinden kan sızması gerekir.

Dişlemiyi kolaylaştırmak için temiz bir pamuk topuyla bastırın ve kalıntı örneği dolaşıma itmek için kuyruğu yukarıya doğru palpe edin. Fareyi sabitleyiciden çıkarın ve kafesine geri koyun. Enjeksiyon denemelerinin sayısını ve enjekte edilen hücre sayısını laboratuvar defterine kaydedin.

Enjeksiyondan sonra hücrelerin canlılığını belirleyin. Daha önce olduğu gibi, bu adım hücrelerin enjeksiyon süreci boyunca hayatta kaldığından emin olunmasını sağlar. Bir enjeksiyon deneyinin sonunda, hücre canlılığı düşecektir ancak %80'in üzerinde kalmalıdır. İsteğe bağlı bir adım olarak, kalan hücreleri santrifüjle çöktürün ve peletleri bir kez PBS ile yıkayın.

Ardından, western blotting gibi gelecekteki analizler için pelletleri -80 °C'de dondurun. Knockdown'larda gen ekspresyonunu doğrulamak için, bir ila iki ay sonra metastazların yerlerini belirlemek amacıyla fareleri disseke edin. Ötanize edilmiş fareyi bir diseksiyon istasyonuna yerleştirerek başlayın.

Fareyi bolca etanol ile püskürtün. Akciğerleri ve kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Ardından bunları dikkatlice çıkarın ve PBS içine yerleştirin.

Hücrelerin karşılaştığı ilk kılcal damar yatağını içerdiği için akciğer, metastaz için birincil bölgedir. Hücreler dolaşıma girdikten sonra, kalbi çıkarın ve akciğerleri PBS ile durulayın, ardından akciğerin her bir lobunu bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. Akciğerin her iki tarafındaki saptanabilir metastaz sayısını sayın, ardından toplam akciğer metastaz sayısını belirlemek için dört lobun tamamındaki akciğer metastaz sayılarını toplayın.

Ardından, makas kullanarak eksizyon yoluyla tekil akciğer metastazlarını izole edin. Her bir metastazı 70 µm'lik bir hücre süzgecine aktarın ve steril bir iğne kapağının ucuyla ince parçalara ayırın. Hücre süzgecini birkaç mililitre besiyeri ile durulayın ve filtreden geçen hücreleri toplayın.

Bir kültür kabında, her kap bir metastazdan alınan hücreleri içerir. Hücreleri 37 °C'de en az dört gün boyunca rahatsız edilmeden inkübe edin. Başlangıçta hem kanser hücreleri hem de fibroblast hücreleri plaklarda büyüyecektir, ancak zamanla fibroblast hücreleri ölecek ve yerlerini kanser hücreleri alacaktır.

Kanser hücreleri herhangi bir ilaç direnç geni taşıyorsa, ilgili antibiyotiklerle hücreleri seçiniz. Üç gün sonra, kapta bulunan kan veya doku kalıntılarını PBS ile yıkayarak uzaklaştırınız ve taze besiyeri ekleyiniz. Elde edilen hücrelerin saflığını, insan spesifik proteinlerine karşı antikorlarla immün boyama yaparak değerlendiriniz; ilaç seçimi yapılmamış olsa dahi burada anti-human mentin antikoru kullanılır. Hücrelerin %99'undan fazlası insan kaynaklı olmalıdır.

Yeni elde edilen hücreler, bu analizin sonunda metastatik yeteneklerini test etmek amacıyla immün yetersiz farelere tekrar enjekte edilebilir. Yüksek derecede metastatik bir kanser hücresi hattı tipik olarak birçok akciğer metastazına yol açarken, düşük metastatik bir kanser hücresi hattından çok az sayıda akciğer metastazı oluşacaktır. Bu görüntüler, insan melanom hücresi hattının enjeksiyonundan iki ay sonraki akciğer metastazlarını göstermektedir.

A 3 7 5 sm. Bu yöntemle türetilen hücreler, test edildiklerinde genellikle parental hatta göre daha fazla metastaz yaparlar. Yine bu analizle, deneysel metastaz analizini gerçekleştirme prosedürünü size göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin kuyruk dokusuna veya çevresine değil, doğrudan kuyruk venine enjekte edildiğinden emin olmak çok önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.