Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, tümöre özgü T-hücresi adaptif transfer immünoterapisinin in vivo etkinliğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle akciğer metastazlarını oluşturmak amacıyla farelere lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla tümör hücreleri transplantasyonu yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, tümör taşıyan farelerin tümöre özgü sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) ile tedavi edilmesidir.

Son adım, tümör nodüllerini görselleştirmek ve nicelendirmek için bir araç olarak Çin mürekkebi kullanmaktır. Nihayetinde, tümör boyutunun ölçülmesi ve tümör nodülü sayısının nicelendirilmesi yoluyla farklı tedavilerin CIE değerlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Mary Zimmerman ve Georgia Tıp Koleji'ndeki Dr. Kevin Lu'nun laboratuvarının bir üyesiyim.

Merhaba, benim adım Shelene Hu. İkinci sınıf öğrencisiyim ve aynı zamanda Dr. Lou'nun laboratuvarında çalışıyorum. Bu tekniğin sağkalım eğrileri gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, bu prosedürün hem kalitatif hem de kantitatif olmasıdır. Tekniklerin uygulamaları, insan kanser hastalarındaki T-hücresi adaptif immünoterapisini taklit ettiği için kanser tedavisine kadar genişleyebilir.

Hadi başlayalım. Tümör hücresi enjeksiyonlarından bir gün önce, %10 serum içeren 10 mL RPMI medyumunda 1x10⁷ CMS4MET hücresi olacak şekilde bir T75 flaskı ekimleyin. Hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için enjeksiyon gününe kadar 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın, ardından tümör hücrelerini 37 °C'de beş dakika boyunca %0,05 trypsin EDTA ile hasat edin. Reaksiyonu %10 serum içeren 10 mL RPMI besiyeri ile durdurun. Hücreleri konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri, oda sıcaklığındaki (RT) bir santrifüjde 1300 RPM hızda üç dakika boyunca çöktürün. Oda sıcaklığında süpernatantı uzaklaştırın, hücreleri yıkamak için 10 mililitre taze 1X HB SS içerisinde yeniden süspande edin. Ardından aynı şekilde tekrar çöktürün ve yeniden süspande edin.

Tümör hücrelerini bir hemo.Cytometer ile sayın. Her bir enjeksiyon için gerekli hücreler yeniden süspanse edilecek şekilde hücreleri HBSS içinde seyreltin. Altı ila sekiz haftalık B SEA farelerini, sıcak su dolu bir beherin içinde ısıtarak toplam 100 mikrolitre hacme getirin.

Kuyruk venini genişletmek için fareyi tezgah üzerindeki bir kuyruk ven sabitleyiciye yerleştirin. Lateral kuyruk venine 100 µL tümör hücresi enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanın. Enjeksiyondan sonra enfeksiyonu önlemek için aseptik teknik uygulayın.

Kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın. Fareyi kafesine geri koyun ve tümörün istenen aşamaya gelene kadar büyümesini bekleyin. Transfer gününde, hazırlanan saflaştırılmış sitotoksik T lenfositlerini veya CTL'leri yeniden süspansiyona getirmek için pipetle aşağı yukarı karıştırın.

Metinde açıklandığı üzere, tüm hücreleri bir plakadan 15 millilitre konik tüpe aktarın ve hacmin tüpün üçte ikisini geçmesine izin vermeyin. Konik tüpe steril bir Pasteur pipeti yerleştirin ve toplam hacim 14 millilitreye yaklaşana kadar hücrelerin üzerine lenfosit ayırma ortamı veya LSM ekleyin.

Katmanları bozmamaya dikkat edin. Oda sıcaklığında 2000 RPM hızda 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işlemi bittikten sonra rotoru yavaşlatmak için freni kullanmayın, CTL'leri yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Yaklaşık 10 mililitre hacimde HBSS ekleyin. Yıkamak için hücreleri oda sıcaklığında, 1300 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Enjeksiyonlar için gerekli hücre yoğunluğuna ulaşana kadar HBSS ile yeniden süspande edin.

Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 µL düzeyinde tutun. Bu videonun daha önceki bölümlerinde görülen kuyruk enjeksiyon tekniğinin aynısını uygulayın. CTL'leri tümör taşıyan farelere enjekte etmek için fareyi kafesine geri koyun ve CTL'lerin tümörle etkileşime girmesine izin verin.

Fareler genellikle CTL tedavisinden 14 ila 21 gün sonra analiz için sakrifiye edilir. Akciğer metastazlarını görüntülemek için, sakrifiye edilmiş bir fareyi sırtı üzerine gelecek şekilde bir strafor levhaya yerleştirin. Trakeaya engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını iğneleyin.

Karın orta kısmından başlayarak ventral tarafı %70 ethanol ile püskürtün. Makas kullanarak göğüs kafesi boyunca orta hat üzerinden tükürük bezlerine doğru kesin. Trakeayı açığa çıkarın.

Trakeayı çevreleyen dokuları uzaklaştırmak için pens kullanın. Bir elinizle tutarak 200 µL'lik bir pipet ucunu trakeanın altına yerleştirin. Trakeayı nazikçe yukarı kaldırarak vücuttan ayırın.

Platformu 180 derece döndürün. Trake üzerinden akciğerlere India ink enjekte etmek için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar akciğerleri mürekkeple tamamen şişirin.

Trakeayı kesmek için makas kullanın. Bir pensetle akciğerlerin altına girerek onları fareden çıkarın. Akciğerleri, kimyasal çeker ocak içindeki bir litrelik su dolu bir beherde kısa süreliğine yıkayın.

Akciğerleri, beş mililitre FTI çözeltisi içeren cam bir kaba aktarın. Tümör dokusu, siyah akciğerler üzerinde beyaz nodüller şeklinde belirecektir. Birkaç dakika sonra tümörler sayılabilir ve FTI çözeltisi içerisinde süresiz olarak saklanabilir.

Meme karsinomu ile transfekte edilmiş farelerin akciğerleri. Cell line four T one hattı, tümörleri belirten beyaz lekeler göstermektedir. IRF sekiz dominant negatif immune K 79 E ile transfekte edilen fareler, tümör hücrelerinin artmış metastatik potansiyelini göstermektedir.

Bu görüntüler, CTL adaptif transfer immünoterapisinin etkinliğinin histolojik analizini göstermektedir. Salin enjekte edilen tümör taşıyıcısı farelerde, altı gün sonra oklarla belirtilen çok sayıda tümör görülmüştür. Diğer yandan, tümöre özgü T hücreleri enjekte edilen farelerde aynı deneyde tümörlerde azalma görülmüştür.

Çin mürekkebi uygulaması, CTL adaptif transferinin etkinliğini ölçmek için daha basit bir yol sunar. Burada, tümör taşıyan akciğerlerdeki beyaz tümör nodülleri, onları CTL adaptif transferi başarıyla gerçekleşmiş akciğerlerden açıkça ayırır ve nodüllerin sayılması, histoloji ile mümkün olmayan bir derecede nicelleştirme sağlar. Bu prosedürü uygularken, daha kolay ve daha doğru kuyruk veni enjeksiyonları için fareleri ısıtmayı hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör boyutunu ve sayısını belirlemeye yönelik bu basit prosedür aracılığıyla tedavinin etkinliğinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.