Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Bu prosedür, iki Arabidopsis transkripsiyon düzenleyicisi olan SEU ve LUH arasındaki in vivo protein-protein etkileşimini test eder. Biyomoleküler floresan komplementasyonu kullanılarak, iki plazmit konstrüktunda SEU sarı floresan proteinin (YFP) N-terminal fragmanına, LUH ise YFP'nin C-terminal fragmanına füzyonlanır. Etkileşimlerini test etmek amacıyla SEU-NYFP ve LUH-CYFP soğan epidermal hücrelerine bombarde edilir.

Seuss ve LUH arasındaki bir etkileşim, YFP'nin uç terminal ve C terminal fragmanlarının çekirdeklerde birleşmesini sağlayarak çekirdeklerde YFP floresansına yol açar. Karanlıkta 16 ila 20 saatlik inkübasyonun ardından, floresansı gözlemlemek için soğan epidermis soyukları bir floresans mikroskobu altında incelenir. Merhaba, ben Maryland Üniversitesi Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nde Dr. Zhi Lu laboratuvarından Courtney Hollander.

Bugün size BioRad Helios gen tabancası kullanarak soğan hücrelerinde protein-protein etkileşimini test etme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, bitki hücrelerindeki protein-protein etkileşimlerini ve protein lokalizasyonunu test etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, her bir kartuş hazırlama işleminin detaylarını gösteren Woods ve Zeto 2008 tarafından hazırlanan JoVE Video Protokolü'nü takip ederek Helios gen tabancası için kartuşları hazırlayın. BIFC için 50 µg toplam plazmid DNA, 12,5 mg altın partikül ve 0,5 mg/mL PVP çözeltisi ile karıştırılır. Aynı kartuş hazırlama yöntemi kullanılarak, etkileşime girdiği varsayılan proteinlerden YFP'nin N-terminal yarısına füzyonlanmış Seuss (NYFP olarak kısaltılmıştır) ve YFP'nin C-terminal yarısına füzyonlanmış LU Homolog (L-U-H-C-Y-F-P olarak kısaltılmıştır) plazmid DNA'ları birleştirilir.

Toplam miktar hazırlık başına 50 µg'dır ve kartuş başına 0.25 mg altın başına 1 µg DNA olacak şekilde toplam 50 kartuş elde edilir. Her bir kartuş tek bir atış içindir. Kartuş hazırlığından sonra, altın partiküllerinin verimli bir şekilde itilip itilmediğini öğrenmek için kartuşları test edin.

Kare şeklinde bir parafilm parçasını bir Petri kabının etrafına sarın. Ardından helyum basıncını 150 ile 200 PSI arasına ayarlayın ve yeni hazırlanan kartuşları parafilm karesine doğru ateşleyin. Parafilm üzerinde hafif altın parçacıkları gözlemleyin.

Farklı helyum basınçlarında parfüme farklı miktarlarda altın parçacığı püskürtülebilir. Ancak, anlamlı bir fark yoksa, bombardıman için daha düşük basıncı seçin. Bu test aynı zamanda her atış işleminin kapsadığı alanı da belirtir.

Soğan dokularını hazırlamak için, temiz ve keskin bir jilet kullanarak büyük bir sarı soğanın dış kabuğunu soyun. Dört ila beş katman derinliğinde, iki çarpı sekiz santimetrelik dikdörtgen bir alan kesin. Dikdörtgen şeklindeki soğan dokusunu çıkarın ve dıştaki iki katmanı atın.

Soğanın geri kalan katmanlarını yaklaşık 1,5 santimetrelik kare parçalar halinde kesin. Soğan parçalarını, içinde 3 mm'lik filtre kağıdı daireleri bulunan bir Petri kabına yerleştirin. Steril su ile nemlendirerek Petri kabının kapağını kapatın.

Soğan parçaları bombardıman için hazırdır. İlk olarak kartuşları beyaz yuvarlak kartuş tutuculara yerleştirin; farklı plazmit yapıları içeren kartuşları farklı kartuş tutuculara yükleyin. Her bir kartuş tutucu, 12 atış için 12 adede kadar kartuş alabilir.

Buraya üç farklı tutucu yüklendi. İlk tutucu, karnabahar mozaik virüsünden kaynaklanan 35 S-G-F-P-A güçlü ve konstitütif promotör içeren kartuşlara sahiptir. Bu plazmid, pozitif kontrol olarak kullanılır.

İkinci tutucu, eşit miktarda S-E-U-N-Y-F-P ve L-U-H-C-Y-F-P içeren deneysel kartuşlarla doldurulur. Üçüncü kartuş tutucusu, puck spine vektörü ve LUH puck spice'ın eşit molar karışımını içeren kartuşlarla doldurulur. Bu aynı zamanda negatif kontrol olarak da hizmet eder.

Bataryayı ve yeni namlu astarlarını Helios gen tabancasına yerleştirin. Hem namlu astarının hem de tabancanın ilgili O-ringlerinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, kartuş tutucu üzerindeki 12 numara işaretinin tabancanın üst kısmına bakacak şekilde boş bir kartuş tutucuyu gen tabancasına yerleştirin.

Kartuş tutucunun doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için bir veya iki kez ilerletin. Ardından tabancayı helyum tankına bağlayın ve basıncı 150 ile 200 PSI arasına ayarlayın. Kulak koruyucu takın ve tetiği çekerken yan düğmeyi basılı tutarak tabancayı birkaç kez ateşleyin. Tabancayı boş kartuş tutucuyla ateşlemek, tabanca haznesini temizler ve basıncın sabit olduğundan emin olur.

DNA atışından önce, arka plan floresansını belirlemek için buraya bir parça soğan atılarak negatif kontrol sağlanabilir. DNA kaplı altın partikülleri fırlatmak için boş kartuş tutucuyu çıkarın ve pozitif kontrol içeren ilk yüklü kartuş tutucuyu yerleştirin. Kartuş tutucuyu, ateşlenmesi planlanan kartuş kartuş tutucunun altına gelecek şekilde ilerletin.

Şimdi soğan parçalarını, en iç tabakası yukarı bakacak şekilde boş bir Petri kabının ortasına yerleştirin. Gen tabancasının namlu astarlarını Petri kabının üzerine dayayın ve tabancayı ateşleyin. Bir sonraki kartuşa geçin ve farklı bir soğan parçasına atış yapın.

Dört ila beş adet soğan parçası bombardıman yapılana kadar bu adımı tekrarlayın. Her bir soğan parçası, bombardıman işleminden sonra yalnızca bir kez işleme tabi tutulur. Bombardıman yapılan soğan parçasını, deneysel kartuşları filizlendirmek için nemli 3 mm filtre kağıdı içeren bir Petri kabına aktarın.

Kartuş tutucuyu değiştirin. İkinci olarak, kontaminasyonu önlemek için namlu astarını değiştirmeyi unutmayın. Pozitif kontrol için az önce gösterildiği gibi dört ila beş soğan parçası ateşleyin.

Ardından, negatif kontrol DNA'sını içeren üç numaralı Holden kartuşuna geçin. Ve tekrar dört ila beş soğan parçası ateşleyin.

Kontaminasyonu önlemek için namlu astarını değiştirin. Bombardımandan sonra, soğan parçalarını içeren Petri kaplarını kapaklarla kapatın.

Kurumayı önlemek için onları parafilm ile sarın. Soğan parçalarını oda sıcaklığında, karanlıkta 16 ila 48 saat inkübe edin. Bombardıman işlemi tamamlandığında, gen tabancasını helyum tankından ayırmadan önce gazı kapatın ve basıncı tahliye edin; ardından namlu astarını sökerek kartuş tutucuyu ve kullanılmış kartuşları çıkarın.

Son olarak, kartuş tutucuları ve namlu astarlarını sabunlu su içeren bir behere daldırarak temizleyin ve 20 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, tüm sabun kalıntılarını gidermek için suyla durulayın.

%70 etanol içinde bir saat boyunca bekletin ve ardından kağıt havlu üzerinde kurutun. Bombardımandan 16 ila 20 saat sonra soğan parçalarının gözlemine geçin. Bombardıman uygulanmış soğan parçalarını oda sıcaklığında 16 ila 20 saat inkübe ettikten sonra, düz uçlu bir pens yardımıyla soğanın iç epidermisinden tek bir hücre tabakasını yavaşça soyun.

Bu, bombardıman sırasında doğrudan tabancaya bakan katmandır. Soyulmuş katmanı, bir lamel üzerindeki bir damla suyun üzerine yerleştirin ve üzerini kapatma camıyla kapatın. Ancak hava kabarcıklarını en aza indirmeye dikkat edin.

Burada gösterilen zes axio observer, point Z one gibi bir floresan mikroskop kullanarak, mikroskobun parlak alan görünümü altında GFP veya YFP floresansını gözlemleyin. Öncelikle hücrelerin canlı olduğundan emin olmak için sitoplazmik akışı kontrol edin. Bunu yapmak için.

Soğan dokusunu ısıtmak için lamı birkaç dakika boyunca parlak alan ışığına maruz bırakın ve ardından hareket eden plastikleri arayın; sitoplazmik akış her zaman kolayca görülmeyebilir, bu nedenle net bir şekilde görünmese bile cesaretiniz kırılmasın. Floresans tespiti için GFP veya YFP'ye uygun eksitasyon ve detektör filtreleri kullanın. Ayrıca, floresan olmayan bir plazmid ile aşılanmış soğan parçaları olan negatif kontrolleri de kontrol edin.

Hasarlı hücrelerden, döküntülerden ve soğanlardan soluk sarı sinyaller gelebilir. Ayrıca, pozitif kontrolleri kontrol edin. Konstitütif olarak ifade edilen floresan raporlayıcı içeren plazmid.

GFP floresansı bazı hücrelerde görülürken hepsinde görülmez. Hava kabarcıkları da arka plan floresansına neden olabilir. Soğan epidermal hücrelerinden gelen görünür GFP sinyalleri; kartuşların, soğan dokularının ve gen tabancası atışının uygun şekilde hazırlandığını ve uygulandığını gösterir.

Burada, 35 SGFP pozitif plazmidden gözlemlenen güçlü floresans gösterilmektedir. Güçlü floresans, hem çekirdek hem de sitoplazma dahil olmak üzere hücrenin tamamında görülmektedir. Parlak alan görüntüsü, hücrelerin ve çekirdeklerin ilgili dış hatlarının görülmesini sağlamaktadır.

Her hücre transforme olmaz. Seuss, NYFP ve L-U-H-C-Y-F-P deneysel kombinasyonu soğan hücrelerine bombardımanla aktarıldığında, YFP floresan sinyalinin soğan hücresi çekirdeğinde tespit edilmesi, Seuss NYFP ile L-U-H-C-Y-F-P'nin in vivo etkileşime girdiğini gösterir. Ancak, bu etkileşim aracılı floresan, pozitif kontroldeki 35 SGFP aracılı floresandan önemli ölçüde daha zayıftır.

Ek olarak, SEUS ve LUH transkripsiyon faktörleri çekirdeklerde yerleşmiştir. Bu nedenle, YFP floresansı yalnızca çekirdekte gözlemlenir. Ayrıca, floresan hücrelerin sayısı, 35 SGFP pozitif kontrolünün sayısından önemli ölçüde daha düşüktür.

Bunun nedeni, B FFC'nin yalnızca her iki partner plazmid aynı soğan hücrelerinde eksprese edildiğinde çalışmasıdır. Negatif kontrolden beklendiği üzere, puck spine, vektör ve L-U-H-C-Y-F-P karışımı içeren üç numaralı kartuş tutucu ile bombarde edilen soğanlarda herhangi bir floresan sinyal tespit edilmemiştir. BioRad Helios gen tabancası sistemini kullanarak protein-protein etkileşimlerini test etmek için soğan hücrelerinin nasıl bombarde edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, uygun pozitif ve negatif kontroller kullanmayı hatırlamak ve BIFC floresansının sinyalinin daha zayıf olabileceğini ve floresan hücre sayısının daha az olabileceğini bilmek önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.