Bimoleküler Floresan tamamlama

Bu deney, iki proteinin hücrelerde etkileşime girip girmediğini belirlemeyi ve bu etkileşim bölgelerinin özelliklerini tanımlamayı amaçlamaktadır. İlk olarak hücreler, ilgilenilen iki proteini kodlayan ekspresyon konstrüktları ile transfekte edilir; bu proteinlerden biri parçalanmış bir floresan proteinin N terminusuna, diğeri ise parçalanmış floresan proteinin tamamlayıcı C terminusuna füzyonlanmıştır. Transfekte edilen hücrelerin kültürde floresan sinyal geliştirmesi beklendikten sonra, protein kompleksleri görüntüleme ve immünoblotlama yöntemleriyle görselleştirilir.

Ardından, toplanan görüntüler Image J gibi görüntüleme yazılımlarına aktarılır. Kontrollü bir deneyde hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu nicelleştirmek için BIFC sonuçları, iskele proteininin SH3 domenlerinin kesişmesi ve PI3KC2β'nin prolin bakımından zengin domeni gibi protein-protein etkileşimlerini ve bu komplekslerin lokalizasyonunu gösterebilir. Bu tekniğin kolokalizasyon, immünopresipitasyon ve FRET gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, BiFC'nin hücredeki daha zayıf ve geçici etkileşimlerin mekansal lokalizasyonuna olanak tanımasıdır. Ayrıca bu yöntem, FRET'te görüldüğü gibi kapsamlı görüntü son işlemleme süreçleri gerektirmez.

Bu yöntem, sinyal iletimi alanındaki temel soruları yanıtlayabilir; örneğin, X ve Y proteinleri etkileşime giriyor mu ve eğer giriyorsa, bu kompleksler hücrede hangi spesifik kompartmanlara yerleşiyor? Genel olarak, bu yönteme yeni başlayanlar, biyopsilerini eksprese etmek için uygun konfigürasyonu seçmedikleri için zorluk yaşayacaklardır. İlgilenilen etiketli proteinler için, BIFC füzyon proteinleri için mevcut çok sayıda florofordan birini seçerek başlayın.

Venus'un amino ve karboksi uçlarının 37 °C'de bir kompleks oluşturabildiğini, buna karşın Y-F-P-B-I-F-C fragmanlarının 30 °C'de ön inkübasyon gerektirdiğini göz önünde bulundurun. BIFC fragmanlarının eklenmesinin ilgilenilen proteinlerin fonksiyonunu nasıl etkileyebileceğini değerlendirerek, bu proteinlere etiket eklenmesi için ekspresyon vektörleri tasarlayın. Örneğin, RA ailesi ve GTP α'lar karboksi ucundan lipid modifikasyonuna uğrarlar ve bu modifikasyonu bozmadan bu uçtan etiketlenemezler.

Transfeksiyon koşullarını belirlemek için her zaman pilot deneyler gerçekleştirin. Ayrıca, sinyal gelişimi için optimal zamanı belirlemek amacıyla hücreleri floresan mikroskobu ile izleyin. Ardından, konstrüktların eşit ifadesini doğrulamak için western blot analizi yapın.

Önemli bir nokta olarak, her örnek plakası için BIFC fragmanlarının eklenmesinin, ilgilenilen proteinlerin hücresel lokalizasyonunu değiştirmediğini doğrulamak amacıyla HA veya flag etiketi için immün boyama yapın. Beş hücre hattının her birinden 1,3 × 10⁴ hücreyi bir cam tabanlı kültür plakasına ve altı kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğuna ekleyin ve hücrelerin gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde çökelmesini bekleyin. Ertesi gün, lipofeksiyon veya tercih edilen başka bir yöntemle transfeksiyon için DNA'ları hazırlayın.

Öncelikle, bir transfeksiyon kontrolü olarak DNA'yı 250 µL serumsuz DMEM içinde seyreltin. Toplam BIFC DNA miktarınızın 50'de biri oranında CFP ekleyin. Şimdi, her 1 µg DNA için 10 µL lipofektamin kullanacak şekilde, lipofektamini 250 µL serumsuz DMEM içinde seyreltin.

DNA ve lipozom dilüsyonlarını karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücreleri ılık, serumsuz DMEM ile iki kez yıkayın. Her bir cam tabanlı plakaya veya altı kuyucuklu plağın her bir kuyucuğuna iki mililitre serumsuz DMEM ekleyin.

Ardından, her bir transfeksiyon karışımını bir cam tabanlı kap ile altılı kuyucuklu plakadaki iki kuyucuğa eşit olarak paylaştırın ve hücreleri 37 °C'de beş saat boyunca inkübe edin. Son olarak, transfeksiyon medyumunu uzaklaştırın ve yerine %10 FBS içeren tam DMEM medyumu ekleyin.

İlgilenilen proteinlerin gerekli ekspresyon seviyelerini elde etmek için hücreleri, pilot deneylerde belirlenen süre boyunca inkübe edin. Pozitif kontrolün floresan olduğunu doğrulamak için transfekte edilen hücreleri epi floresan mikroskop altında inceleyin. Canlı hücre görüntüleme için hücreleri PBS ile üç kez durulayın.

Hücreleri indikatör boya içermeyen medyumla besleyin. Sabitlenmiş hücrelerin görüntülenmesi için %2 paraformaldehit ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Ardından, hücreleri üç kez PBS ile durulayın, üzerlerini 1 mL PBS ile kapatın ve 4 °C'de karanlıkta saklayın, ardından altı kuyucuklu plakadaki hücreleri hemen lize edin. Western blot analizleri için, lize edilen hücrelerin görüntüleme yapılan hücreleri temsil etmesi amacıyla tüm hücrelerin aynı anda hazırlanması önemlidir. Tag proteinlerinin eşdeğer düzeylerde eksprese edildiğinden emin olmak için western blot gerçekleştirin.

Konfokal mikroskop ile hücre görüntüleme yapılırken, örnekler arasındaki floresansın karşılaştırılabilir olması için deney boyunca ayarların sabit tutulması önemlidir. Piksellerin doyuma ulaşmadığı tekil hücrelerin görüntülendiğinden emin olun. CFP transfeksiyon kontrolü olarak eklendiğinden, BIFC sinyallerinin analizi için yalnızca CFP pozitif hücreleri seçin.

Image J gibi bir görüntüleme yazılımı kullanarak floresan miktarını belirleyin. Görüntü dosyalarını Image J'de açın. Analyze set measurements sekmesine gidin. Ölçümler kutusundaki area ve mean gray value seçeneklerini işaretleyin. Bu örnekte, venöz görüntülerin yeşile ve CFP görüntülerinin kırmızıya pseudo-renklendirildiğini unutmayın.

Serbest seçim aracını kullanarak, CFP kanalında hücrenin tamamının kenarları boyunca bir taslak çizin ve bu taslağı yerinde bırakın. YFP kanalına geçin. Analiz sekmesine giderek, her görüntü için hücre başına ortalama floresan yoğunluğunu yansıtan ortalama gri değerini ölçün.

Hücre içermeyen bir alanda YFP kanalında bir daire çizin. Bu alanı arka plan olarak ölçün. Arka planı her bir görüntüden çıkarın.

Son olarak, bir hücre popülasyonu için ortalama floresan yoğunluğunu hesaplamak için, tek bir örnekte görüntülenen tüm hücrelerin ortalama derece değerinden arka plan değerini çıkararak ortalamasını alın. İdeal olarak, üç deney boyunca 60 hücreyi nicelendirin. Kesişen çok alanlı iskele proteini, yeni bir sınıf iki PI 3 kinaz olan PI3KC2β'nin düzenlenmesi yoluyla nöronal sağkalımı düzenler; intersecting SH3 domenleri, PI3KC2β'nin amino terminalindeki prolin açısından zengin bölge ile etkileşime girer. VN etiketli intersecting ile VC etiketli PI3KC2β'nin transfeksiyona tabi tutulması, YFP kanalında, kompleks oluşumunu belirten ve yalancı renk olarak yeşil boyanan floresan bir sinyalle sonuçlanır.

Burada kırmızıyla yalancı renklendirilmiş CFP, transfekte hücreleri işaretlemek için kontrol olarak kullanılmıştır; PI3K2beta'nın prolin açısından zengin alanındaki mutasyonlar, intersectin ve PI3K2beta'nın birlikte çöktürülmesini bozarak BIFC sinyalini azaltır. BIFC sinyalindeki bu fark, yabanıl tip ve PA PI3K proteinlerinin ekspresyon farklarından kaynaklanmamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, BIFC sinyalindeki farklılıkların ekspresyon farklarından değil, kompleks oluşumundaki farklılıklardan kaynaklandığından emin olmak için uygun kontrolleri çalıştırmayı ve protein ekspresyonunu kontrol etmeyi unutmamalısınız.

Bu komplekslerin birbirlerine karşı farklı afiniteleri nelerdir gibi soruları yanıtlamak için, örnekler üzerinde yüzey plazmon rezonansı gibi diğer teknikler uygulanabilir.